细胞生物学实验

FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞

一、 实验目的

a) 了解凋亡细胞的变化及检测方法。

b) 了解FITC-AnnexinV/PI双染色法检测凋亡细胞的原理及方法。

二、 实验原理

a) 细胞凋亡是细胞内由多个基因控制的死亡程序被活化而导致的细胞自杀

（cell suicide）。膜磷脂酰丝氨酸原来位于细胞膜的内部。在细胞凋亡早期，细胞膜上的膜磷脂酰丝氨酸外翻与AnnexinV结合，使其被染成绿色。在细胞凋亡晚期，细胞膜破裂，使得PI进入细胞当中与DNA结合，使其被染成红色。

b) 细胞坏死（cell necrosis）：是由外部化学、物理或生物因素的侵袭而造成

的细胞崩溃裂解，也被描述为细胞谋杀（cell murder）。

c) 喜树碱（ camp tothecin， CPT）是一种植物来源的抗肿瘤药物，可诱导

肿瘤细胞凋亡。

d) Annexin V是一种可与磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）特异结合

但不能通过正常细胞膜的物质。碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一种发出红色荧光的DNA结合染料，也不能透过活细胞完整细胞膜。 e) 细胞凋亡早期，细胞膜PS由膜脂双层内侧转位至外侧， FITC标记的

AnnexinV（AnnexinV-FITC）即可与其结合，使细胞膜处呈绿色。细胞凋亡中晚期，膜通透性变大，PI可进入细胞与核内DNA结合。

f) 激光共聚焦显微镜（LSCM）以单色激光作为光源，并用附设光源针孔

(pinhole)使光源成为点光源.除此之外，在检测器前方也有一个检测针孔，点光源对标本内焦平面上的每一检测针孔后的光电点扫描，标本上的被照射点在检测针孔成像，由倍增管或冷电耦合器件逐点或逐线接受，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于光源针孔和检测针孔，焦平面以外的点不会在检测针孔成像，这就是所谓的“共聚焦”，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。多通道LSCM还可同屏采集显示3个不同发射波长的荧光色及1个混合色图像，对研究2种或2 种以上物质的共存有明显优点。在显微镜的载物台上加一个微量步进马达控制载物台的升降，最小步进距离为0.1μm，使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本的各个光学横断面的图像，实现“光学切片”的目的。通过不同的焦平面产生的光学切片，可得到一块较厚标本的三维图像，这是LSCM最重要的作用之一。将存储在计算机中的光学切片的焦平面信息结合起来，即可描述该标本的三维图像。目前LSCM最大有效解析厚度为0.45mm，扫描最小距离为0.1μm。

g) 流式细胞分选仪的作用原理：当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样

品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均

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匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。流式细胞分选技术是利用流式细胞分选仪，以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备。分选后的细胞能直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。硬件中样本细胞丢弃的比例低于5%，保证样本中目标细胞的高回收率。

三、 实验仪器及试剂

a) 材料：提前7天接瘤，并在实验前24~48h 腹腔注射用生理盐水配制的

羟基喜树碱溶液诱导凋亡。 b) 试剂：

i. 1mg/mL羟基喜树碱溶液。 ii. 0.01mol/L PBS（pH7.4）。

iii. AnnexinV- FITC凋亡检测试剂盒。

iv. 2mg/mL的PI贮存液：用pH7.4的PBS配制，-20℃保存（3个月）。

用时在PBS中稀释1500倍。

v. 5mg/mL DAPI贮存液：甲醇配制， -20℃保存（3个月）。用时在PBS

中稀释10000倍。

c) 用品

i. 激光共聚焦显微镜、 10mL低速离心机、流式细胞分选仪

ii. 剪刀、10mL一次性注射器及针头、乳胶手套、酒精棉球、10mL离

心管、胶头吸管、EP管、10mL离心管、载玻片、吸水纸、载玻片染色盒（缸）等

四、 实验步骤

a) b) c) d)

离心收集腹水瘤细胞。抽取腹腔液，1500 r/min离心5 min，弃上清液。 用PBS洗涤细胞。1500 r/min离心5 min，弃上清液。 用PBS配制10%细胞悬液。 4、AnnexinV-FITC/PI染色。

i. 在1.5 mL eppendorf管中加入10%的肿瘤细胞悬液0.5 mL，2000 r/min

离心5 min，弃上清液。

ii. 加入0.5 mL 结合缓冲液悬浮细胞。

iii. 按试剂盒要求加入适量AnnexinV-FITC混匀，避光，室温染色15 min iv. 按浓度要求加入适量PI贮存液，染色5 min。 e) 制备装片，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。 i. 正常细胞：荧光光源时不被观察。

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ii. 凋亡早期细胞：荧光光源时膜显示绿色。

iii. 凋亡晚期细胞：荧光光源时膜显示绿色、核显示红色。 iv. 坏死细胞：荧光光源时核呈红色、膜绿色荧光不明显。

f) 流式细胞仪分选。合并细胞样品，以10%未染色细胞为内参，分选收集

FITC阳性细胞。

五、 实验结果

如上图所示，细胞膜被染成绿色，细胞核被染成红色的细胞为凋亡细胞。其细胞膜上明显的突出即为细胞凋亡后期的凋亡小体。图中一些不在细胞上的绿色荧光小体，可能是已经脱落下来的凋亡小体。另外，图中一些不被染色且细胞表面光滑的细胞为正常细胞。

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如上图所示，基本的信息都与第一个图中一致，但是这个图中还包括很多细胞形状的周围很大一部分被染成淡绿色，但是内部并没有被染成红色的核。这些细胞可能是坏死细胞，细胞膜破碎扩散导致周围一片都被染成绿色，但是可能细胞内的核质已经外流或者消失，所以不见被染成红色的核。 （分选后可能是量太少，导致在激光共聚焦显微镜中无法观察到染好色的凋亡细胞。） 六、 实验分析

a) 实验中的所有染色过程都必须避光，因为在光情况下染料易分解，在最

后共聚焦荧光观察时观察就不明显。

b) 在分选细胞以后，在共聚焦显微镜下无法观察到凋亡细胞，而将细胞悬

液量加多一点在普通显微镜下观察却可以观察到凋亡细胞，这可能是因为在共聚焦显微镜下观察能加的量太少，而使细胞不容易观察到。 c) 与前两组的毫无细胞进行对比后发现，在细胞分选时应该在接收管中加

少许的缓冲液，防止细胞在进入接收管时直接打在管壁上被打碎。 七、 实验注意事项

a) 尽量避免荧光染料、染色过程及染色标本暴露于光下。

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b) PI等DNA结合染料有致癌性，操作时应注意自我防护及环境保护。 c) Annexin V和PS的结合需要钙离子，如自己配制结合缓冲液，一定要含

钙离子；加Annexin V-FITC反应后避免用PBS（不含钙离子）洗涤细胞，以防脱色。

d) 胰酶与EDTA会抑制凋亡细胞与Annexin V-FITC结合，若是贴壁细胞，消

化后一定要将胰酶和EDTA洗涤干净。

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