和敏感细胞的结合/粘附能力；采用内吞特异性抑制剂及分子生物学手段干预特定的内吞途径，研究新型化疗纳米药物的细胞摄取机制；采用共聚焦显微镜观察及流式细胞仪实时检测新型纳米药物的入胞速度与程度，并使用荧光探针标记溶酶体、内质网、线粒体和细胞核等，实时监测新型化疗纳米药物进入细胞后的胞内分布情况，揭示新型化疗纳米药物的组成、结构和理化特性等对其进入肝癌耐药细胞和敏感细胞中的过程及胞内行为的影响及其与降低肝癌细胞耐药性之间的关系。

③ 新型化疗纳米药物对肝癌干细胞的作用研究

通过检测肝癌干细胞球囊形成率、克隆形成率、体内成瘤能力等，研究新型化疗纳米药物对肝癌干细胞自我更新及分化能力的作用；通过测定肝癌干细胞及其肝癌组织中干细胞相关基因的表达，揭示新型化疗纳米药物进入肝癌干细胞的能力对肝癌干细胞“干性”变化的影响；通过划痕试验、Matrigel transwell试验及体内研究等，揭示新型化疗纳米药物对肝癌干细胞从原发瘤解离，向周围侵润、迁移、生长繁殖和形成转移瘤等能力的影响，探讨新型化疗纳米药物通过杀伤或干扰肝癌干细胞的自我更新、分化来抑制肝癌转移与复发的效果。 ④ 新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的体内药效学评价

构建肝癌耐药细胞的原位肝癌模型和皮下植入模型，研究新型化疗纳米药物对模型动物的体重变化、肝功能、肿瘤生长抑制情况和生存期等的影响，从动物水平上评价新型化疗纳米药物降低肝癌细胞耐药性的效果，并对现代医疗技术（超声、射频消融、介入栓塞等）与新型化疗纳米药物联用降低肝癌细胞耐药性的效果进行评价。

（3） 新型纳米药物调控肝癌免疫微环境的机制和药效学研究 ① 新型免疫治疗纳米药物清除Treg等的机制研究

将小鼠肝癌细胞系H22肿瘤细胞直接注射入BALB/c小鼠肝组织，建立BALB/c

小鼠原位肝癌模型，消化肝癌组织，采用免疫磁珠与流式细胞分离方法从肝癌组织中分选Treg等，通过检测其对CD3+ T细胞增殖的影响研究这些抑制性免疫细胞的免疫抑制功能，采用流式细胞术和免疫组化法分析Treg等的数量及在肝癌组织中的分布，探讨新型免疫治疗纳米药物对Treg等的清除作用；分别采用抗CD11c、

CD3和CD56抗体从肝癌组织中分选DC、CTL和NK细胞，通过体外培养法分析DC的抗原提呈和CTL、NK细胞对肿瘤细胞的杀伤，多色流式细胞术分析DC、CTL和NK细胞的数量、流式细胞术检测CD80、CD86和MHCII表达以分析DC的成熟，检测IFN-γ活性来分析CTL、NK细胞功能，探讨抑制性免疫细胞的清除对肿瘤免疫细胞的影响；采用ELISA法检测TGF-β、IL-10、VEGF、IL-12、IFN-γ和IL-2等的含量，荧光定量RT-PCR及免疫组化法检测这些免疫细胞因子的表达及在肝癌组织中的分布，探讨抑制性免疫细胞的清除对免疫细胞因子的影响。另外，观察荷瘤小鼠存活时间、肿瘤组织大小，结合肿瘤组织病理学分析手段，评价新型免疫治疗纳米药物的治疗效果。

② 新型免疫治疗纳米药物中和免疫抑制因子的机制研究

建立BALB/c小鼠原位肝癌模型，分别采用ELISA法、荧光定量RT-PCR及免疫组化法分析TGF-β等的含量、表达及在肝癌组织中的分布，探讨新型免疫治疗纳米药物对这些免疫抑制因子的中和作用；采用流式细胞术和免疫组化分析Treg等的数量及其在肝癌组织中的分布，探讨免疫抑制因子的中和对抑制性免疫细胞的影响；采用多色流式细胞术分析DC、CTL和NK细胞的数量、DC的成熟及CTL、NK细胞功能，探讨免疫抑制因子的中和对肿瘤免疫细胞的影响；经中和免疫抑制因子TGF-β等的免疫治疗纳米药物处理后，观察小鼠存活时间、肿瘤组织大小，结合肿瘤组织病理学分析手段，研究新型免疫治疗纳米药物对肝癌治疗效果的影响。 ③ 新型免疫治疗纳米药物和化疗纳米药物协同增效的机制研究

建立BALB/c小鼠原位肝癌模型，采用上述针对抑制性免疫细胞和免疫抑制因子的新型免疫治疗纳米药物与化疗纳米药物序贯联合治疗，研究其对肝癌的协同增效作用。采用流式细胞术和免疫组化法分析Treg等的数量及其在肝癌组织中的分布，多色流式细胞术分析DC、CTL和NK细胞的数量、DC的成熟及CTL、NK细胞功能，探讨免疫治疗纳米药物和化疗纳米药物联用对抑制性免疫细胞和肿瘤免疫细胞的影响；采用ELISA法检测上清中TGF-β、IL-10、VEGF、IL-12、IFN-γ和IL-2等的含量，探讨免疫治疗纳米药物和化疗纳米药物联用对免疫正向相关因子和免疫抑制因子的影响；探讨现代医疗技术（超声、射频消融和介入栓塞等）与新型免疫治疗纳米药物联用对肝癌治疗效果的影响。

④ 新型纳米药物对肝癌免疫炎症反应的调控研究

建立BALB/c小鼠原位肝癌模型，经新型纳米药物处理后，采用ELISA、RT-PCR和Western blot分析肝癌组织中炎症相关因子IL-1、IL-6、IL-17、IL-23、CCL2、TNF-α、IFN-γ、iNOS、COX-2、IL-10和TGF-β等的含量和表达，化学发光法及Western blot检测转录因子NF-κB的p65和p50、AP-1的c-jun和c-fos的活性及表达，探讨新型纳米药物的组成、结构和理化特性对肝癌组织中促炎因子及抑炎因子的影响，进一步采用基因芯片揭示肝癌免疫微环境、炎症反应模式的变化规律。 （4） 新型纳米药物体内过程研究与生物安全性评价 ① 新型纳米药物突破肝癌生理屏障的体内过程研究

分别测定透明质酸、胶原或葡萄糖胺聚糖等胞外基质成分在肿瘤组织中的含量，评价新型纳米药物对纤维化样胞外基质的破坏作用；测定肿瘤血管中的血流速率，考察新型纳米药物对血流动力学行为的影响；对纳米药物进行荧光标记，建立光漂白荧光恢复技术测定新型纳米药物在肝癌血管和肿瘤细胞间质的移动速度；建立激光共聚焦技术结合MATLAB分析，测定新型纳米药物在肝癌微环境的传输距离；采用上述方法研究新型化疗纳米药物的理化特性（如粒径、电荷、形貌和靶向修饰等）对其在肝癌微环境的运动速度和传输距离的影响，并对纳米药物共输送技术、现代医疗技术（超声、介入栓塞等）与新型纳米药物联用克服肝癌生理屏障的效果进行评价。 ② 新型化疗纳米药物的药物动力学研究

采用荧光标记或同位素标记技术对新型纳米药物进行标记，测定纳米药物载体在不同时间、不同器官和组织中的浓度；建立生物样本中不同形式化疗药物（游离药物、血浆蛋白结合药物和被包裹药物）浓度的测定方法，研究纳米载体和化疗药物在动物体内的分布、转运和排泄等动力学过程，计算化疗药物在不同组织的药时曲线下面积（AUC），评价新型化疗纳米药物的肝靶向效率。采用上述方法研究新型化疗纳米药物的理化特性对其体内过程的影响，阐明化疗纳米药物的理化特性与体内过程的相关性。通过对几个基元过程进行研究，用能够反映离散与随机特征的数学方法评价新型纳米药物静注后在模型动物上的动力学行为。

建立活体荧光显微定量技术，定量测定新型纳米药物经静脉注射或介入栓塞治疗后在肝癌血管和胞外基质的分布，研究纳米药物在肿瘤血管、肿瘤间质和肝

癌细胞转运的动力学行为；用微透析技术结合HPLC/LC-MS等分析方法研究新型化疗纳米药物在肝癌组织中的释药行为。按照上述方法研究新型化疗纳米药物的理化特性对其在肝癌组织中转运与释药过程的影响。根据原位肝癌的病理特征，在模型中引入药物释放常数、血流速率或细胞间质压力等参数，建立新型化疗纳米药物在模型动物肝癌组织中的动力学模型，阐明化疗药物浓度与上述参数之间的相关性。

③ 新型免疫治疗纳米药物的药物动力学研究

建立用于免疫治疗药物的生物样本预处理方法和药物浓度测定的免疫分析方法（ELISA）或色谱分析法，从动物水平研究免疫治疗纳米药物在模型动物体内分布、转运和排泄的动力学过程；在局部组织水平研究免疫治疗纳米药物在肝癌组织中转运的动力学过程和释药行为；考察新型免疫治疗纳米药物的理化特性对其整体和局部组织药物动力学行为的影响，阐明免疫治疗纳米药物的理化特性与其体内过程的相关性。

④ 新型纳米药物的生物安全性评价

对新型纳米药物及相关纳米载体，采用毒理学的方法，在动物（如小鼠、大鼠、兔和犬等）水平上进行包括急性毒性、长期毒性和一般药理学等安全性研究；采用形态观察如组织病理切片和生化检测等方法，考察其对分布较多的组织或器官（如淋巴组织、血液和骨髓等）和重要器官（如心、肝、脾、肺和肾等）的形态和功能的影响；采用NMR代谢组学技术对各组织器官损伤的标志物进行分析，对新型纳米药物是否存在潜在毒性进行评价。

通过测定P450、细胞色素b5及参与药物代谢的主要亚型酶的活性，研究新型纳米药物及相关纳米载体对肝药酶活性的影响；通过细胞生物学和分子生物学手段，研究新型纳米药物对正常肝细胞形态、活性和功能的影响；通过测定免疫器官（如胸腺及脾）重量以及免疫细胞、免疫相关蛋白在外周血中数量的变化，研究新型纳米药物对免疫系统的影响；采用PFC法等手段开展体液免疫检测，研究体内特异性抗体产生、特异性T细胞反应等；采用荧光分光光度计和荧光显微镜分析巨噬细胞吞噬等特性，研究新型纳米药物对吞噬细胞吞噬功能影响。

通过血小板血栓生成、溶血和白细胞减少等细胞水平反应、凝血系统、纤溶系统激活等血浆蛋白水平反应研究新型纳米药物的血液相容性；参照国家标准