(1)基因表达载体构建的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。 (2)基因表达载体的组成

(3)基因表达载体的构建过程：一般用同一种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。 2.将目的基因导入受体细胞

(1)转化的含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 (2)转化的方法 ①导入植物细胞

a.农杆菌转化法：最常用方法。将目的基因导入双子叶植物和祼子植物。 b.基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。 c.花粉管通道法。 ②导入动物细胞 a.方法：显微注射技术。 b.常用受体细胞：受精卵。 ③导入微生物细胞 Ⅰ.方法

a.用Ca处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。

b.感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子。

Ⅱ.受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。

Ⅲ.原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。 合作探究

1.基因表达载体的构建相关问题思考

(1)为什么切割目的基因和载体要选用同一种限制性核酸内切酶？

答案 选用同一种限制性核酸内切酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。

(2)在实际的基因工程操作时往往用两种限制性核酸内切酶分别切割目的基因的两端以及载体，这样做有什么好处？试分析原因。

2＋

答案 ①如果用一种限制性核酸内切酶切割，目的基因两侧的末端以及质粒切口的两个末端都是互补的，因此连接时可能会出现载体与载体、目的基因与目的基因、目的基因与载体三种连接情况，而符合要求的只有载体与目的基因的连接。②如果用两种不同的限制性核酸内切酶进行切割就可以有效避免载体与载体以及目的基因与目的基因的连接，提高连接的有效性。

(3)分析基因表达载体模式图，回答下面问题。

①用于构建基因表达载体的质粒为什么必须具有启动子和终止子？启动子和终止子与起始密码子和终止密码子是一回事吗？

答案 导入到受体细胞的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子。与起始密码子和终止密码子不是一回事，启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。而起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。

②能否将目的基因插入载体的标记基因中？为什么？

答案 不能。标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。 2.将目的基因导入受体细胞相关问题思考

(1)结合教材P13生物技术资料卡分析，用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。

答案 需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。

(2)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上？

答案 农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。

(3)植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？

答案 植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。

(4)为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？

答案 微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。

3.农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：

(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现 。

具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到 (部位)即可。 (2)根据T-DNA这一转移特点，推测该DNA片段上可能含有控制酶合成的基因。 (3)图中c过程中，能促进农杆菌向植物细胞转移的物质是类化合物。 (4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还可采取(至少写出两种)。

答案 (1)单子叶植物 将目的基因导入植物细胞 染色体的DNA T-DNA片段(内部) (2)DNA连接酶、限制 (3)酚 (4)基因枪法、花粉管通道法

解析 (1)一般农杆菌不能感染的植物是单子叶植物，可感染双子叶植物和裸子植物。利用其感染性，可实现目的基因导入植物细胞。真正可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上的是农杆菌T-DNA片段，因此目的基因必须插入到该部位才能成功。(2)根据T-DNA这一转移特点，可以推测该DNA片段能控制合成DNA连接酶、限制酶以实现与双子叶植物细胞染色体DNA的整合。(3)植物细胞受伤后可产生酚类物质，促进农杆菌向植物细胞转移。(4)植物基因工程中除了农杆菌转化法之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。 一题多变 判断正误

(1)获得上述转基因植物的核心步骤是a( ) (2)上题图中过程b可以用Ca处理细菌( )

(3)用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，从而把目的基因导入植物细胞，在这

2＋

个过程中所有细胞都导入了目的基因( ) (4)农杆菌转化法常用的受体细胞是花粉细胞( ) (5)在过程a中只需要DNA连接酶的参与( )

(6)用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，要经过植物组织培养才能获得表现出新性状的植物( )

(7)因病毒能够侵染正常细胞，有的病毒还能将自己的核酸整合到宿主细胞的染色体上，所以动植物病毒也可作为基因工程的载体( )

答案 (1)√ (2)√ (3)× (4)× (5)× (6)√ (7)√

三、目的基因的检测与鉴定

1.目的基因的检测

(1)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因：采用DNA分子杂交技术。主要做法是用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，检测受体细胞的DNA中有无目的基因。显示出杂交带，说明目的基因已经插入染色体DNA中。

(2)检测目的基因是否转录出了mRNA：采用分子杂交技术。具体做法与DNA和DNA分子之间杂交相同，只是它从受体植物中提取的是mRNA而不是DNA，杂交带的显现也与DNA和DNA分子之间杂交相同。

(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质：采用抗原—抗体杂交法。具体做法是：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已经表达了。 2.个体水平鉴定

包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否具有抗性及抗性的程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。 合作探究

1.DNA分子杂交的原理是什么？除了用于目的基因的检测与鉴定以外，试举例说明还有哪些应用？

答案 碱基互补配对原则。还可用于亲子鉴定、刑事侦察、生物亲缘关系确定等。