病原菌分离方法

一、 实验原理：

植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。

二、 实验用具：

酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等

三、 实验前的准备工作：

1、 煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml

（1） 将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml

左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。

（2） 三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后

再加热煮沸，小火使其充分融化。

（3） 加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，

分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。

2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。

四、 实验步骤：

1、 用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。 2、 取样，病斑大小约20个（含病缘线）

3、 分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）

（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装

(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）

（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基

约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝

后即为平板。

4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精 （2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min （3）无菌水冲洗2~3次 5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗

（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。 （3）用封口膜封口后倒置

（4）于25℃~26℃培养箱内培养并观察。(圆斑菌：孢子25°菌丝26°，灰斑：孢子19℃