实验八 质粒DNA的微量制备（碱裂解法）

【 原 理 】

在EDTA存在下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿–异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质等。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程产生的泡沫，并能使离心后水层，变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，获得质粒DNA。

【 试剂和器材 】 一、试剂 1．LB液体培养液：胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L，用NaOH调节至pH7.5。。 2．TEG缓冲液（pH8.0 25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，50mmol/L葡萄糖，4mg/ml溶菌酶）：称取0.3g Tris加入0.1mol/ＬHCI溶液14.6ml，先配制成pH8.0Tris–HCl缓冲液100ml，再加入0.37g EDTA-Na2· 2H20和0.99g葡萄糖，临用前加入400mg溶菌酶。

3．碱裂解液（0.2mol／L NaOH、1％SDS）：称取0.8g NaOH和1g SDS定容至100ml。 4．乙酸钾溶液（pH4.8）：取60ml 5mol／L KAc（或称取29.4g KAc）加入11.5ml冰乙酸和28.5ml蒸馏水。

5．1mol／L pH8.0 Tris–HCl缓冲液：Tris 121.14g/L，用盐酸调至pH8.0。 6．氯仿：异戊醇=24:1（Ｖ/Ｖ），等体积的酚和氯仿/异戊醇溶液混合。放置后，上层若出现水相，可吸出弃去，有机相置棕色瓶内低温保存。

7．TE缓冲液（10mmol／L，pH8.0 Tris-HCl，l mmol/L EDTA）：称取0.12g Tris，加适量蒸馏水溶解，用1mol／L盐酸调至pH8.0并定容至100ml，加入0.037ｇEDTANa2 · 2H20。

8．抗菌素（如pBR322质粒加入氨苄青霉素50μg／ml培养基，四环素12.5μg／ml培养基）

二、器材

1．水平振荡器 2．高压灭菌器 3．接种环 4．灭菌试管

5．Eppendorf离心管 6．离心机 7．滤纸 三、材料

1．携带pBR322质粒的E.coli HBl01菌株。 【 操 作 】

1．培养细菌扩增质粒

根据质粒的抗性于3ml LB液体培养基内加入适当的抗菌素（如pBR322质粒加入氨苄青霉素50μg／ml培养基，四环素12.5μg／ml培养基）。

用接种环挑取1个单菌落或吸取少量菌液于含上述双抗LB液体培养基的灭过菌管中，37℃，振荡培养12h左右。

2．收集菌体和裂解细菌

取1.5ml培养液置Eppendorf离心管内，离心，5000r/min，5min，弃去上清，保留菌体

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沉淀。如菌量不足可再加入培养液，重复离心，收集菌体。

将菌体沉淀悬浮于预冷的150μl TEG缓冲液内，剧烈振荡、混匀，室温放置10min。 加入200μl新鲜配制的碱裂解液，加盖，颠倒数次，轻轻混匀，冰上放置5min。 3．分离纯化质粒DNA

加入150μl冰冷却的乙酸钾溶液，加盖后温和颠倒数次混匀，冰浴放置15min，使沉淀完全。

4℃下离心，12000r/min，5min。乙酸钾能沉淀SDS与蛋白质的复合物，并使过量SDS–Na＋转化为溶解度很低的SDS–K＋一起沉淀下来。离心后，上清液若仍混浊，应混匀后再冷至0℃，重复离心。上清液转移至另一干净的Eppendorf管内。

加入等体积的酚/氯仿饱和溶液，反复振荡，离心，12000r/min，2min，小心吸取上层水相溶液，转移到另一个Eppendorf管内。

上述溶液加入2倍体积的预冷无水乙醇，混合摇匀，于冰浴上放置10min。4℃下离心， 300r／min，5min，弃去上清液。并将Eppendorf管倒置在干滤纸上，空干管壁粘附的溶液。

加入70％冷乙醇lml，洗涤沉淀物，离心，弃去上清液，尽可能除净管壁上的液珠，放置干燥或真空干燥，即得质粒DNA制品。

将DNA沉淀溶于20μlTE缓冲液（临用前加入20μg／ml RNaseA），置-20℃保存。

【 实验结果与讨论分析 】

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实验九 质粒的酶切与电泳鉴定实验

【 原 理 】通过质粒DNA浓度测定、质粒DNA限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA片段的试验，掌握用分光光度计测定DNA含量、用限制性内切酶酶解质粒DNA以及用琼脂糖凝胶电泳分离鉴定质粒DNA的方法。

在基因工程中，DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的DNA序列，在一定的条件下切断双链DNA。选择合适的限制性内切酶对质粒DNA 酶切，酶切产生粘性末端。

【 试剂和器材 】 一、试剂 酶切缓冲液

EcoRⅠ酶解缓冲液（10×）：1 mol/L pH 7.5 Tris·HCI，0.5 mol/L NaCI，0.1 mol/ L MgCI2。 HindⅢ 酶解缓冲液（10×）：0.1 mol/L pH 7.4 Tris·HCI，1 mol/L NaCI，0.07 mol/L MgCI2。 TBE缓冲液（10×）：称取Tris 108 g，硼酸55 g，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 40 ml，用H2O定溶到1000 ml，高压灭菌作为10×贮液，稀释10倍后作为工作液使用。

TE缓冲液：10 mmol/L Tris·HCI，1 mmol/L EDTA pH 8.0，其中含有 20 μg/ml Rnase 1ul。 上样液及其他试剂 上样液（6×）：0.25 % 溴酚蓝，质量体积比为40%的蔗糖水溶液。 溴化乙啶染色液（10 mg/ml）：在20 ml H2O中溶解0.2 g溴化乙啶，混匀后于4℃避光保存。

氯仿，异丙醇，70 % 乙醇。 二、仪器

微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统等。 三、材料

含有质粒pBluescript或pGEM-3Zf的大肠杆菌DH5α、DL2000 Marker、EcoRⅠ、HindⅢ 限制性内切酶、琼脂糖等。

【 操 作 】

1. 用分光光度计测定质粒DNA的浓度

（1）用蒸馏水将待测DNA样品做1:200倍的稀释。

（2）用蒸馏水作为空白，在波长为260 nm、280 nm调节分光光度计读数至零。 （3）加入DNA稀释液于以上2个波长处读取OD值。 （4）记录OD值，通过计算确定DNA浓度，公式如下：

DNA浓度（μg/μl）=OD260×稀释后总体积/稀释量×50/1000 2. 质粒DNA的酶切

将上一实验提纯并溶于20 μl TE的质粒DNA用于双酶切，按下表分别加入所需试剂。

质粒 酶切缓冲液 酶液

16μl 2μl 各1μl

加样后小心混匀，置于37℃水浴或金属浴中酶切1小时（有时可以长一点至，数小时或过夜），65℃水浴5min或向管中加入Loading buffer 4 μl来结束酶切反应，取5μl样品进行电泳分析。

3. 琼脂糖凝胶的制备

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（1）琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8 g琼脂糖，置于三角瓶或小烧杯中，加入100 ml TBE工作液，置于微波炉加热直至琼脂糖完全溶解（注意不要让液体沸腾出瓶外），加入1μlEB染色液，混匀。

（2）胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净、晾干，放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心的倒置在有机玻璃内槽上，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30 min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上即形成相互隔开的上样孔。将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电泳缓冲液TBE的电泳槽中备用。 4. 加样

用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面，本实验样品孔容量约10 μL左右。 5. 电泳

加完样后的凝胶板可以通电进行电泳。建议在80 V~100 V的电压或20 mA下电泳。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。在低电压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系。但在电场强度增加时，不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围会随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5 V/cm。电泳温度视需要而定，对大分子DNA的分离以低温为好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5% 时，由于胶太稀，最好在4℃进行电泳。 6. 观察和拍照

DNA存在处显示出桔红色的荧光条带。一般紫外光激发30 s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼睛或有机玻璃防护面罩，避免眼睛受到强紫外光损伤。采用凝胶成像系统拍摄电泳带谱。

【 实验结果讨论 】

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