【 实验结果讨论 】

蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值>1.8；当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。 【 思考题 】

1．若样品中含有蛋白质，应如何排除干扰? 2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正? 【 实验结果与讨论分析 】

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实验六 RNA分离和提纯实验

【 目的和原理 】

目的在于了解和掌握RNA制备的方法、操作步骤、注意事项和技术关键。

RNA的分离提纯目前多用苯酚法。组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠存在下，RNA与蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀而达到分离目的。

【 试剂和器材 】

1．250 g/L SDS：称取十二烷基硫酸钠25 g，溶于50％乙醇中至100 ml，室温存放。 酚：分装于棕色瓶中。

2．0.05 mol/L醋酸缓冲液（pH 5.0）：0.5 mol/L 醋酸钠35 ml，0.2 mol/L 醋酸15 ml ,加蒸馏水稀释至1000 ml，混匀后测pH应为5.0。

3．2 mol/L 醋酸钠：取无水醋酸钠16.4 g，用蒸馏水溶解后配成100 ml。

4．0.1TPC水：在试剂瓶中，DEPC与无菌去离子水按0.1%（V/V）比例混合，37℃放置2小时，121℃高压灭菌30分钟。

（备注：配制以上试剂时均用0.1TPC水处理的蒸馏水。） 【 操 作 】 1. 准备工作

玻璃器皿用0.1mol/L NaOH浸泡过夜，自来水反复冲洗后，蒸馏水冲洗两遍，180℃烘烤4小时。Tip头和EP管等塑料制品用0.1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌备用。双蒸水和溶液用DEPC处理，即每100ml水或溶液加0.1ml DEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30min使DEPC失活。电泳槽用3%双氧水浸泡20～30min，再用0.1%的DEPC水冲洗。为免未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0.5%SDS处理。 2. RNA的提取—Trizol法提取总RNA

（1）组织匀浆 从液氮中迅速取出组织样品，放在已灭菌烘干的陶瓷研钵中，倒入少量

液氮，将其研成白色细末；按每100mg组织加1ml Trizol的比例加入Trizol试剂，用枪头迅速搅匀后，转到1.5ml的EP管中。

（2）离心4℃，12 000r/min离心10min，将上清液移到新的EP管中（若上清顶层有一层

脂肪，应去除）。 （3）相分离 按初始使用的Trizol量，每1ml Trizol加0.2ml氯仿于上清液中，盖紧管盖，

在15～30℃下温育5min，彻底去除核蛋白复合物；4℃，不超过12 000rpm 离心15min，取上层水相。

（4）沉淀RNA 将上清液转到新的EP管中，按初始使用的Trizol量，每1ml Trizol加

入0.5ml异丙醇，混合使RNA沉淀；15～30℃温育10min；4℃，不超过12 000rpm 离心10min。

（5）RNA沉淀的洗涤 去上清，按初始使用的Trizol量，每1ml Trizol加1ml 75%乙醇

于沉淀中，吹打混匀后，4℃，7 500r/min离心5min。

（6）RNA的重溶与保存 去上清，使RNA沉淀风干或自然干燥（勿让沉淀完全干燥）；

用不含RNase的灭菌水（如用100μl DEPC水）溶解RNA，置于-70℃ 保存。另外，在75%乙醇洗沉淀后，取一部分放在-20℃贮存，用时再离心重溶。 3. RNA的浓度和质量检测

（1）RNA的浓度测定 从RNA原液中取10μl，用DEPC水稀释至400μl，测定样品的

A260和A280值。根据A260和A280比值，估测RNA浓度和提取质量（一般A260和A280比值在1.8～2.0之间，可以满足实验要求）。RNA浓度计算公式为：

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原液浓度（ng/μl）=A260×稀释倍数×40 【 注意事项 】

1．在RNA的提取操作中，有条件应在0~4℃进行。

2．RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染，在实验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液，甚至灰尘中都有RNA酶的存在，因而RNA酶的的降解作用是RNA提取中致命的问题，在提取RNA的全过程必须在清洁无尘的环境中进行，操作人员要使用一次性的手套拿取物品，穿工作服，戴口罩。

3．酚有腐蚀性，操作时应小心，若沾洒在皮肤上立即用水或用70%酒精棉球擦洗。 【 实验结果与讨论分析 】

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实验七 RNA甲醛变性凝胶电泳

【 原理 】

甲醛是一种常用的RNA变性剂。在进行甲醛电泳分析时，必须先配制含有甲醛的胶体，RNA也必须先以甲醛进行变性处理，以确保其二度结构充分被打开。由于甲醛可能是一种致癌物质，配制胶体及进行电泳分析时都应该在通风橱里小心操作；进行电泳时所使用的缓冲液为MOPS。此外，含有甲醛的胶体比较滑溜，容易破裂，在移动胶体时应特别留神。由于rRNA占细胞RNA总量的80~85%，染色后呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large与small rRNAs（真核生物为28S与18S，原核生物为23S与16S）；散布于small rRNA附近，呈淡淡smear的就是mRNAs，这是因为mRNAs存在量不多，而且长度不一的缘故。长度较短的5SrRNA及tRNA等则在胶体下方也以特定色带呈现。

【 试剂和器材 】

1．配制1.2%甲醛变性电泳凝胶：其中琼脂糖占1.2%，10×MOPS占10%，37%甲醛占3%。

例如：配制30ml甲醛变性电泳凝胶：称取0.36g琼脂糖溶于26.1ml DEPC处理的水中→冷却至60℃→加3ml 10×MOPS和0.9ml 37%甲醛，加入少量EB。

2．电泳液为1×MOPS。 【 操 作 】 1．样品处理：（25μl）

RNA（多达10-15μg）：2μl 10×MOPS：2.5μl 37%甲醛：4.4μl

甲酰胺：12.5μl DEPC-H2O：3.6μl

2．混匀后离心→55℃水浴15min→迅速冷却→加5μl加样缓冲液。如此处理是为打开RNA的二级结构

3．电泳：66伏电压，1小时。 【 注意事项 】

1．甲醛胶脆、易碎。

2．甲醛蒸汽有毒，应在通风橱中配制。 【 实验结果与讨论分析 】

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