实验四 琼脂糖凝胶电泳分离DNA
【 原 理 】
所谓“凝胶”是指在一定形状的制胶容器中所形成的包含电解质的多孔支持介质。当核酸分子位于凝胶的某个部位，在电场中核酸分子将向正极移动。DNA分子由于两条链相互配对形成双螺旋结构，随着DNA链长度的增加，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，这样，不同长度的DNA片段表现出不同的迁移率，因而可依据DNA分子的大小将它们分开。通过染色和与标准相对分子质量的DNA的对照来进行检测。琼脂糖凝胶电泳的分辨率较聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，但在分离范围上优于聚丙烯酰胺凝胶电泳，并有便于制备和操作的优点。一般琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2～50kb范围内的DNA片段。而聚丙烯酰胺凝胶电泳一般适用于分离小片段的DNA（5～500 bp），在这个范围内相差仅一个碱基的 DNA分子都能获得较满意的分离效果，如在DNA序列测定时常用含变性剂的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。
用琼脂糖凝胶分离DNA在分子生物学研究中是经常使用的方法，这主要是因为琼脂糖凝胶具有操作方便、制备容易快速、凝胶机械性能好、分离DNA片段范围广等特点。DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。
DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子或片段泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外（电荷效应），还与DNA分子的大小和空间构象有关（分子筛效应）。DNA的相对分子质量越大，其电泳的迁移率就越小；超螺旋的DNA与同一相对分子质量的开环或线状DNA的电泳迁移率也明显不同。
琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅0.5～1/1g，超薄平板型琼脂糖凝胶所需样品DNA量可以更低。凝胶浓度与被分离DNA样品的相对分子质量成反比关系，一般常用的凝胶浓度为1%～2%。在电泳的形式上常用平板型电泳，因为平板型电泳可将多个样品和标准相对分子质量DNA放在同一块胶上进行电泳，使各样品在相同的条件下进行电泳，便于相互间的比较。
电泳时，用溴酚蓝示踪DNA样品在凝胶中所处的大致位置，但每种DNA样品所处的确切位置需要用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 对DNA分子进行染色才能确定。溴化乙啶可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，与DNA分子形成一种荧光络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含EB的溶液中浸泡，但小分子DNA浸泡时间过长容易引起扩散，故可根据被分离DNA分子的大小选择不同的染色方法。溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。
【 试剂和器材 】 一、试剂 1．TBE×l0缓冲溶液（0.89mol/L Tris–0.89 mol/L硼酸–0.025 mol/L EDTA缓冲溶液）：取108g Tris，55g硼酸和9.3g EDTA（EDTANa2 · 2H20）溶于水，定容至1 000mL，pH=8.3。作为电泳缓冲溶液时应稀释10倍。
2．溴酚蓝–甘油指示剂：0.05g溴酚蓝溶于100ml 50%甘油中。 3．50%甘油
4．0.5mg/L溴化乙啶染色液：取5mg溴化乙啶，用少量去离子水溶解，定溶至10ml。取1 ml稀释至1 000ml。
5．琼脂糖
6．样品DNA：2.5mg DNA溶于100ml TBE缓冲溶液中。 7．标准相对分子质量DNA。
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二、器材
1．电泳槽及胶床 2．电泳仪 3．乳胶管 4．微量进样器 【 操 作 】 （一）制胶
1．取琼脂糖1 g，加pH＝8.3的TBE缓冲溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成1%的琼脂糖胶液。此胶液可立即使用，或置于冰箱中保存，临用前在沸水浴中熔化即可。
2．采用垂直柱型电泳时，取制胶用的玻璃管（10cm×0.6cm）若干，将玻璃管的一端用一小段乳胶管套住，并塞以玻璃珠封住管底，向管底滴加2滴50%的甘油。
3．将已熔化的琼脂糖胶液加入玻璃管中，待琼脂糖凝固后，取下乳胶套管，将凝胶管侧放，让凝胶从玻管中滑出，放平，用刀片将凝胶一端切平，留下约9cm长的凝胶柱，并用去离子水和电极缓冲溶液冲洗以去除甘油。将玻璃管的一端用尼龙纱网套住，以防管中凝胶滑出（注意平端向上）。将凝胶管接到电泳槽上，上、下槽加入TBE电泳缓冲溶液。
（二）加样
取样品DNA 40μL，加10μL溴酚蓝－甘油指示剂，混匀，用微量注射器上样。 （三）电泳
电泳时控制电流强度在2～5mA/管范围内，当溴酚蓝指示剂距管底1cm左右时断电，结束电泳。
（四）染色
1．电泳完毕后，将凝胶管从电泳槽中取出，一手按住上管口，另一手摘去尼龙纱网套，然后慢慢松开上管口，将凝胶放入试管中。
2．向试管中加入0.5mg/L溴化乙啶染色液，浸泡染色20～30分钟，染色液可以重复使用。将染色后的凝胶放在紫外灯下观察，有DNA的位置会呈现出橙黄色的荧光，可在紫外灯下进行拍照记录。也可以将溴化乙啶放入胶中（终质量浓度为0.5mg/L），电泳后可在紫外灯下直接观察结果。
3．注意：溴化乙啶是一种强致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行处理。
【 实验结果 】
1．天然双链DNA电泳所采用的缓冲溶液有：Tris–醋酸–EDTA（TAE）、Tris–硼酸–EDTA（TBE）或Tris–磷酸–EDTA（TPE）等。TAE缓冲容量较TBE和TPE低，长时间电泳易导致其缓冲能力丧失。在电泳分辨率上三者差不多，只是超螺旋DNA在TAE缓冲体系中分辨率更好一些。
2．电泳中，溴酚蓝和500bp大小的DNA一起移动，这可给泳动最快的DNA片段提供一个指征。但在不同浓度的凝胶中，溴酚蓝相对应的DNA片段的大小是不同的。
3．如电泳后DNA条带不是尖锐清晰而是形状模糊，可能是由于以下几种原因：①DNA加样量太大；②电压太高；③加样孔破裂；④凝胶中有气泡。
【 注意事项 】
1．Amberlite XAD–16或活性炭可用于净化被EB（溴乙啶）污染的物体表面。
2．溴化乙啶是一种强致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行如下处理：
方法I：（1）每100ml溶液中加非离子型多聚吸附剂Amberlite XAD-16.29g； （2）室温下放置12小时，不时摇动；
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（3）用新华1号滤纸过滤，弃滤液；
（4）用塑料袋封装滤纸和Amberlite树脂，作为有害废物丢弃。 方法Ⅱ：（1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭； （2）室温条件下放置1小时，不时摇动； （3）用新华1号滤纸过滤，弃滤液；
（4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物丢弃。
溴化乙啶在260℃分解，在标准条件下进行焚化后不会有危险性。
【 实验结果与讨论分析 】
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实验五 核酸含量测定——紫外分光光度法
【 目的和原理 】
1．学习和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量的原理及技术。 2．熟悉紫外分光光度计的基本原理与使用。
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值（即光密度或称光吸收）。RNA的E（P）260 nm（pH7）为7700~7800。RNA的含磷量约为9.5%，因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.022~0.024。小牛胸腺DNA钠盐的E（P）260 nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1微克DNA钠盐的光密度值为0.020。
蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
【 试剂和器材 】 一、试剂
1．钼酸铵-过氯酸沉淀剂：如配制200ml，可在193ml蒸馏水中加入7ml高氯酸和0.5g钼酸氨。
2．样品RNA或DNA干粉。 3．5%~6%氨水 二、器材
1．容量瓶（50毫升） 2．离心管 3．离心机
4．紫外分光光度计 【 操 作 】
1．用分析天平准确称取待测的核酸样品500mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量水稀释。然后用5%~6%氨水调至pH7加蒸馏水定容到50ml。于紫外分光光度计上测定260nm光吸收值，计算核酸浓度：
RNA浓度（μg/ml）=（A260×N）/（0.024×L） DNA浓度（μg/ml）=（A260×N）/（0.020×L）
式中，A260——260nm波长处光吸收读数；L——比色皿的厚度，1cm；N——稀释倍数
2．如果待测的核酸样品中含有大分子核酸，需加钼酸氨-高氯酸沉淀剂，沉淀除去，测定上清液260nm波长处A值作为对照。
取两支离心管，向第一支管内加入2ml样品溶液和2ml蒸馏水，向第二支管内加入2ml样品溶液和2ml沉淀剂（以除去大分子核酸）作为对照。混匀，在冰浴中放置，30min后离心（3000rpm），从第一、第二管中分别吸取0.5ml上清液，用蒸馏水定容到50ml。用光程为lcm的石英比色杯于260nm波长处测其光吸收值(Al和A2)。计算核酸浓度：
RNA或DNA的浓度（μg/ml）=（A1-A2）×N/（0.024或0.020×L） 核酸%=（1ml待测液中测得的核酸维克数/1ml待测液中制品的维克数）×100
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