实验三 DNA的PCR扩增实验（多聚酶链反应）

【 原 理 】

通常的DNA扩增法是分子克隆法。首先要构建含有目的基因的载体，然后将其转入细胞后进行扩增，再用同位素探针进行筛选。这种方法，需经过DNA内切、连接、转化和培养等有关过程，操作复杂，一般需数周时间才能完成，而PCR基因扩增法只需几小时，就可用电泳法检出0.1微克基因组DNA中仅含数个拷贝的摸板序列，所以，这种基因扩增法又称无细胞分子克隆法。

PCR基因扩增是一种特定区段DNA的复制，其复制方式是以半保留形式进行的。PCR扩增法的DNA复制，必须有DNA模板、DNA聚合酶、DNA引物及四种dNTP。如图16-1所示，要扩增模板DNA中A-B区间的DNA片段，首先要设计二条寡核苷酸引物A’和B’，PCR扩增DNA的特异性是由这二条人工合成的引物质决定的。A和B片段的DNA序列是已知的，这是PCR扩增的必要条件，但A-B中间的序列未必清楚。A段和B段序列的长度一般为15-20个碱基，据此可用DNA合成仪人工合成与A、B对应互补的二个引物A’和B’，PCR扩增系统中的模板DNA经过高温变性分解二条单链后，又进行降低温（55-37℃），引物退火，与互补的模板DNA结合，形成局部的双链，这是DNA复制的固定起点，即延伸的固定起点。如图16-1所示，A和A’结合，B和B’相结合，退火的时间为1～2分钟。

PCR扩增过程中，链的延伸具有方向性，以引物为固定起点，延伸才能进行。目前使用的DNA多聚酶，合成DNA的方向都是从5’端到3’端。当温度升至中温（60–72℃）时，在多聚酶的作用下，四种dNTP会迅速以旧链为模板合成新链，其合成方向，若以A’和B’引物而言，都是从5’端到3’端的方向进行。PCR扩增片段的长度范围，从数百个至2kb个碱基。在此扩增中，真核细胞和原核细胞没有明显的差别，其扩增的长度由引物来限定。模板DNA经过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环过程。每循环一次，模板DNA的拷贝数加倍，第一次循环由一条模板双链DNA变成二条；第二次循环，则变成4条；第三次循环，就变成8条??，以几何级数扩增下去，一般扩增循环是30-35次，最后形成特定的DNA片段。PCR扩增DNA特定区段，是由人工合成的二条引物决定的，这是PCR扩增的关键。

【 试剂和器材 】 一、试剂

1．Taq DNA多聚酶

在PCR 100μl反应体系中，Taq DNA多聚酶用量为1–2.5单位．由于DNA的不同和引物的不同，以及其他条件上的差别，则多聚酶的使用量亦有差异。如果酶的浓度偏高，会出现非特异性产物堆积；如酶的浓度偏低，则合成产物的量少。因此，常常根据电泳的结果决定酶的最佳用量。

2．三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） dNTP 用 NaOH 贮存（pH7.0），最初的贮存液可稀释到10mmol/L，分装后存放于－20℃冰箱内。使dNTP工作储存液为lmmol/L，其使用浓度为20–200μmol/L之间，这四种的dNTP必须以当量浓度配合，以减少错配误差。在PCR反应中，使用低dNTP浓度，可减少在非靶位置上启动和延伸时核苷酸错误掺人。决定最低dNTP浓度是根据靶序列的长度和组成。例如，在100μ1的反应体系中，四种dNTP的浓度使用20μmol/L，基本能满足合成2.6μgDNA或10pmol的400bp序列。使用低dNTP浓度，能够高灵敏扩增ras基因点突变的等位基因。

3．引物

引物的浓度一般为0.1～0.5μmol/L之间。引物的浓度偏高，会引起错配和非特异性产

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物的堆积，同时能增加生成引物二聚体的几率。非特异性产物和引物的二聚体，竞争使用酶，引物及dNTP，结果是特异性产物的量降低。

典型引物包括15–30个核苷酸，组成中含有45–55%的G+C，计算的Tm值与使用的引物对应一致。为此，可使用拇指规则计算A或T、G或C的温度校正系数。应用上：希望Tm值在55–80℃ 之间。首先要避免两条引物的3’末端互补，以生成引物的二聚体；应避免在G+C富集序列上的错配；还应避免引物内的回文序列。这些都是设计引物应遵循的原则。

4．镁离子

选择合适的镁离子浓度是很重要的。其浓度可影响到引物的退火，模板和PCR中间产物的链解离温度，产物的特异性，引物二聚体的生成及酶的活性等。在PCR反应系统中，镁离子浓度0.5–2.5mmol/L之间，超过了dNTP浓度。如果浓液中存在EDTA，或在引物贮备液中有其他螯合物或DNA模板，会干扰镁离子的浓度。因此，应适当调整镁离子的用量。

5．其他反应组成物 （1）Tris–HCl

在PCR中使用10–50mmol/LTris–HCl（pH8.3–8.8，20℃ ）缓冲液，双极化离子缓冲液。

（2）KCl

KCl 浓度为50mmol/L，它能促使引物退火。NaCl 的浓度为50mmol/L，而KCl浓度大于50mmol/L时，将会抑制Taq DNA多聚酶的活性。

（3）牛血清蛋白，明胶或非离子型生物去污剂，能帮助稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml，有些操作中也可不加蛋白，亦能获得良好的结果。

二、器材 1．PCR仪 2．EP管 【 操 作 】

一、 PCR的基本操作

在微量离心管内，加PCR用缓冲液、四种脱氧单核苷酸（dNTP）溶液，耐热性多聚酶、两个合成DNA的引物、微量的模板DNA及适量的水。然后将离心管放入PCR基因扩增仪内进行扩增。将上述溶液加热，使模板DNA互补退火，形成部分的双链；再将溶液反应温度升至中温，在耐热性多聚酶的作用下，以dNTP为原料，以引物为复制的起点，模板DNA的一条双链，在解链和退火之后延伸成为两条双链。如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段，这三次改变温度为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次或30次以上的循环，最终使基因放大数百万倍。将扩增产物进行电泳。经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下，用肉眼能见到扩增的特异区段的DNA带。

其规范操作由下列三部分组成： 1．25μl反应体系的PCR

在0.5ml的离心管内，加入如下试剂：

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DNA模板 1μL 引物 两种：上游引物 1μL 下游引物 1μL dNTP 四种 1μL Buffer 2.5μL Taq DNA多聚酶 0.2μL 蒸馏水 18.3μL 总体积 25μ1

2．PCR三个阶段的温度控制

变性温度 95℃ 15秒 引物退火 5℃ 30秒 新链延伸 72℃ 1.5分

3．循环25次～35次

开始时，模板DNA变性时间要适当延长，最后一次循环的延伸时间要保持5分钟．反应终止要立即冷却到4℃或加入10mmol/L EDTA以终止反应。

二、 PCR反应的基本条件 1．引物的退火

引物退火温度和所需时间的长短取决于反应体系中的基本组成、扩增引物的长度和浓度。实际使用的退火温度要比扩增引物的Tm值低5℃。因为TaqDNA多聚酶的活性温度范围很宽，引物延伸将在低温下获得。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L），退火仅需要数秒即可完成。严格规定退火温度，特别是前几个循环中，会增加扩增的特异性。

2．引物的延伸

延伸时间的长短取决于模板序列的长度、浓度及延伸温度的高低，引物延伸在72℃条件下进行，因为72℃时核苷酸补位的速度为35～100个核苷酸/秒，其速度取决于缓冲液的组成、pH值、盐的浓度和DNA模板的性质。

3．变性时间和温度

模板DNA和PCR产物的变性不充分是PCR失败的主要原因。变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。在变性中，温度太高或反应时间过长，都会导致酶的活性损失。所以，掌握好变性时间和温度是十分重要的。

4．循环次数

当其他参数选定之后，循环次数主要取决于模板DNA的浓度。循环反应的次数过多，则非特异性产物的量亦增多；但循环次数太少，则特异性扩增产物的产率低。在标准模板细胞浓度下，循环反应的参考的界线如下表。

【 注意事项 】

1．污染。PCR能够从极少的样品，例如一根毛发，甚至从一个细胞中，分离出其中的DNA作为模板，对其特定序列进行大量地扩增。如果样品污染了，特别是扩增系统中混入了以前扩增的靶序列，将会与样品一样大量的扩增，使试验结果难以区别。

2．设对照试验。即除不加入模板DNA之外，试验的全过程与本实验与完全相同的条件步同步进行。扩增之后，对照试验不出现扩增电泳带，说明PCR操作过程中没有受到污染。如果对照试验出现扩增电泳带，则说明PCR操作过程中已被污染。因此，设对照试验是必要的。

3．隔离操作。PCR扩增仪应与PCR操作场所分开。如果通过对照试验证实样品易被污染时，则PCR操作应在生物反应橱中进行。操作中应戴未污染薄胶手套，所用的试剂及操作器具应尽可能放在专用柜内。

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4．试剂的配制。分装与保存都应在无PCR产物的环境中进行。引物的合成和纯化也要在无PCR产物的环境中进行。试剂分装的量及其浓度应与操作的用量、浓度基本一致，避免再次分装造成污染。

5．使用PCR专用的加样器。PCR专用的微量加样器不可兼作另用。EP管和Tip头也应用新品。移液时应慢吸慢吹出，不能过快。

6．应细心操作。离心管开盖或上盖时都要非常小心，谨防溶液雾化或外溅。加液的离心管开盖之前应先离心一下。尽可能减少样品操作次数。扩增产物电泳带要用新刀片切割，并一定用保鲜纸（薄膜塑料）事先铺在紫外线透射仪表面上，以避免污染。 【 实验结果与讨论分析 】

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