实验七 鉴定RNA的细胞化学方法一Branchet反应

一、实验目的：

通过实验了解Branchet反应的原理及操作方法，观察DNA、RNA在细胞内分布的主要位置。

二、实验原理：

Branchet反应是鉴定细胞内的RNA的一种标准方法，主要是利用核酸分子上的负电荷(PO43-)与带正电荷的碱性染料结合形成盐键而在原位沉淀显色，所以它可以同时染出RNA和DNA。

Unna试剂中的甲基绿(methyl green)和DNA亲和力高，派若宁(Pyroin)和RNA 亲合力高。因此DNA可被染成兰绿色，而RNA被染成红色，通过观察细胞内不同颜色所分布的位置，可初步判断DNA和RNA在细胞内的分布情况。

三、实验用品:

(一)材料：蚕豆根尖石腊切片 (二)试剂：

l、Unna染色剂：

甲液：5％ Pyronin水溶液 6ml 2％ methgl green水溶液 6ml 蒸馏水 16ml 乙液：1M醋酸盐缓冲液(PH4.8) 16ml

甲乙两液分别置4~C冰箱备用，用时两液混匀。 2、5％三氯醋酸

3、0.1％RNase的醋酸缓冲液(PH4．8) 4、二甲苯

5、乙醇(70％，85％，95％，100％) 6、丙酮 7、中性树胶

四、实验方法:

(一) Brachet反应：按如下所示步骤进行操作

l、脱蜡：切片 二甲苯I 3-5分 5-10分 二甲苯Ⅱ 5-10 分 l／2 （二甲苯+纯酒精)

2、复水： 100％乙醇 85％乙醇 70％乙醇 蒸馏水

对照片I 90℃水浴 5％三氯醋酸 70％乙醇 15分 对照片II 室温 0.1％RNase 10-15分

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2分 2分 2分 蒸馏水 3、染色：Unna染色 蒸馏水

10-30分 4、分色： 丙酮

10-30分 5-10分 5-10分 5、透明： 1／2(二甲苯+丙酮) 二甲苯I 二甲苯Ⅱ

6、封片：已染色的标本盖玻片中性树脂封片。

7、镜检。

（二）油镜观察

l、RNA被Unna试剂染成红色；DNA被Unna染色成兰绿色，注意两种颜色的分

布区域。

2、在对照片I中，DNA与RNA被三氯醋酸抽提；在对照片Ⅱ中，RNA被RNase 处理，而DNA不受影响，分别观察之。

30分 1-2分 五、作业：

l、 镜检后，说明RNA和DNA在细胞内的分布情况。

2、仔细观察两种对照片，说明与正常片有何区别。并加以解释，以此说明Brachet

反应对证明RNA的存在的可靠性。

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实验八 Feulgen 反应显示DNA

一、实验目的：

l、掌握显示DNA的主要方法一Feulgen反应。 2、了解石蜡切片的一般过程。

二、实验原理:

DNA经1mol／L HCL水解后，连接嘌呤碱基与脱氧核糖的糖苷键断裂并在

脱氧核糖的第一位碳原子上形成游离的醛基，这些醛基就在原位与Schiff试剂特异性反应，生成紫红色的化合物,亚硫酸水可使碱性品红(红色)变为无色品红，从而消除了非特异性染色造成的误差。这样就可以定性，定位甚至定量地测定细胞内DNA的分布和含量。若再用亮绿复染，可使细胞质，核仁染上绿色。

三、实验用品:

(一) 器材：立式染色缸，恒温水浴，载玻片，小镊子，切片机，显微镜等。 (二) 试剂：

l、Camog固定液：无水乙醇60ml，氯仿30m1．冰乙酸10ml混匀。 2、乙醇：配成100％，95％，85％，70％等各级浓度。 3、二甲苯，切片石蜡，树胶。

4、5％三氯乙酸水溶液：5克三氯乙酸溶于100毫升蒸馏水中。 5、1mol／L HCl。

6、Schiff试剂：取l克碱性品红溶于200毫升沸的重蒸水中振荡5分钟，冷至恰为 50℃时过滤，在滤液中加20毫升lmol／l HCl，冷至25℃加1克NaHS03，置

于暗处12—24小时，加2克活性炭振荡1分钟后过滤，在0—4℃暗处密封保存，配好的试剂应为无色，略有红色则应重配，所用的玻璃器皿应绝对清洁。

7、亚硫酸水：自来水500ml，加入3克亚硫酸氢钠和20ml lmol／L HCl摇匀，瓶

塞要盖紧。此液必须在使用前配制，否则S02逸出即失效。

8、0．5—1％亮绿：亮绿0．5一l克溶于lOOml蒸馏水中。 (三)材料：小鼠肝、肾、小肠或睾丸，洋葱根尖或大蒜根尖。

四、实验内容:

(一)动物细胞石蜡切片Feulgen反应。

1、取材：新鲜材料以生理盐水洗净后切成1—2mm小块。

↓

2、固定： Camog 固定液

↓ 2—4小时

3、脱水： 100％ 乙酸

↓ 30分钟一1小时

4、透明： 二甲苯I

↓ 30分钟一1小时 二甲苯Ⅱ

↓ 30分钟一1小时

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5、浸蜡： 2／3体积二甲苯+1／3体积石蜡 ↓ 40分钟

1／2体积二甲苯+1／2体积石蜡 ↓ 40分钟 纯石蜡

↓ 1小时

6、包埋：纸盒包埋材料，修整蜡块，粘于方木上。 7、切片：以石蜡切片机切成7μm薄片。

8、展片：45℃水浴使材料舒展后贴于玻片上，并于60℃温箱烤片过夜，至此做成 石蜡切片。

9、脱蜡： 二甲苯I

↓ 5—10分钟 二甲苯Ⅱ

↓ 5—10分钟

1／2体积二甲苯+1／2体积无水乙醇 ↓ 3—5分钟

10、复水： 100％乙醇

↓ 2—3分钟 95％乙醇

↓ l一2分钟

85％乙醇

↓ 1一2分钟 70％乙醇

↓ l一2分钟

对照片 蒸馏水 5％三氯醋酸

1-2分

↓ 1一2分钟 11、稀酸水解 lmol／L HCI 90℃15分钟 ↓ 室温1分钟 1mol／L HCl

↓ 60℃水浴8分钟 lmol／L HCL

↓ 室温1分钟 蒸馏水 ↓

12、显色： schiff试剂

↓ 37℃避光30—60分钟 13、分色： 亚硫酸水I

↓ 1.5—2分钟 亚硫酸水Ⅱ ↓ 2分钟 亚硫酸水Ⅲ ↓ 2分钟

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