实验四 细胞活体染色技术
一、实验目的：
l、学习细胞活体染色的方法。
2、观察动、植物活细胞内线粒体，液泡系的形态、数量与分布。
二、实验原理：
活体染色是利用某些无毒或毒性较小的染色剂，在不影响细胞生命活动的情况下显示细胞的天然构造，更具真实性。活性染色又分为体内活体染色和体外活体染色。
詹纳斯绿B(Janus green B)能够活染线粒体为蓝色，主要是由于线粒体内膜上的细胞色素酶系使染料始终保持在氧化状态(即有色状态)，在周围的细胞质内，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。
中性红是液泡系的特殊活体染色剂，它可将不同发育时期的液泡染成不同深度的红色，在细胞处于生活状态下细胞质和核不被染色，该染料对液泡系具有一定专一性。
台盼蓝(trypan blue)是一种偶氮类酸性染料，它可以通过死亡细胞的质膜而使细胞着色，但不能通过活细胞的质膜，故可用台盼蓝鉴别活细胞与死细胞。
三、实验用品：
(一)材料：黄豆根尖、洋葱、小鼠。 (二)器械：显微镜、镊子、刀片、’剪刀、解剖针、表面皿、载玻片、盖玻片、
吸管、收水纸等。
(三)试剂： l、Ringer氏液
NaCl 0．90g KCl 0．42g CaCl2 0．25g 2、1／3000中性红溶液
先配制l％的中性红Ringer氏源液，因中性红难溶解，需稍加热，(30℃一40℃)
使之溶解，过滤，将滤液装入棕色瓶中暗处保存，临用前取少许源液用Ringer氏液稀释成1／3000的中性红溶液。 3、1／5000詹纳斯绿B
先配制1％詹纳丝绿B溶Ringer氏溶液，方法同上。 4、台盼蓝染色液
将l克台盼蓝溶于100毫升生理盐水中 5、香柏油、二甲苯、蒸馏水等。
四、实验方法：
(一)液泡系的中性红活体染色
l、用双面刀片将黄豆芽根尖 (约l一2cm2) 处小心纵切断面，一定要薄且均匀。 2、在载玻片中央滴加中性红染料。使材料在其中染色5一10分钟。
3、吸去染料，滴加Ringer氏液一滴，盖片、镜检、注意液泡系染成什么颜色，
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其形态、大小如何、分布位置。
(二)线料体的活体染色
l、用植物细胞观察线粒体的活体染色
(1)用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块(约lcm2)，放在载玻片上用1/5000詹纳斯
绿B染色约30分钟。
(2)吸出染液，滴加Ringer氏液，盖片、镜检，注意观察线粒体分布及所呈形
状。
2、用动物细胞观察线粒体的活体染色。
(1)取鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入盛有Ringer氏液的表面皿中洗去血液。 (2)将肝组织洗净后吸去血液，加入1／5000詹纳斯绿B染液染色30分钟，注意不
可将组织块完全淹没。
(3)染色后撕开组织块，这样溶液中就会有一些细胞或细胞群。
(4)用吸管吸取溶液，放在载玻片的Ringer氏液中。垫两根短头发，加盖玻片，即
可镜检。
(5)用油镜观察活染色的线粒体标本，要不断地来回转动细调焦螺旋，使盖玻片上
下慢慢移动。使材料总是得到氧气，线粒体的染色才显得非常清楚。 3、人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察 （1）取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1／5000詹纳斯绿B溶
液。
(2)用牙签取口腔上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10 一15分钟(注意不能干燥)，盖上盖片，吸去多余的溶液，即可镜检。 （三）台盼蓝染色鏊别死活细胞。
抽取小鼠腹腔水细胞涂于洁净载玻片上，滴加l％台盼蓝1滴，盖上盖玻片于显 微镜下观察。
五、作业:
l、所观察到的液泡大小是否有差别，染色深度是否一样，并绘图加以说明。
2、所观察到线粒体分布在细胞何处．呈什么颜色，其形状如何，绘图加以说明。 3、比较线粒体在动、植物中的分布、颜色，其形状如何?
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实验五 植物细胞骨架的光学显微观察
一、实验目的：
观察光学显微镜下细胞骨架的结构，了解显示植物细胞骨架的方法及其原理。
二、实验原理：
细胞骨架是指在细胞中支持和连接细胞各组分，以及与细胞运动有关的结构，它包括微管、中间纤维、微丝。当用适当浓度的Triton X一100处理时，可将细胞内大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却仍被保存，经过固定和考马斯亮蓝R250染色，从而在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。
三、实验用品：
(一)器材：显微镜、50ml烧杯、滴管、容量瓶、载玻片、盖玻片、镊子。 (二)试剂：
1、M一缓冲液：50mmol／L眯唑，50mmol／L kCl：，0.5 mmol／LMgCl2，
lmmol／L EGTA(乙二醇双(a一氨基乙酸)醚四乙酸)0．1mmoL／L EDTA，lmmol／L巯基乙醇或DTT(二硫苏糖醇)。 2、6m mol／L PH6．8磷酸缓冲液。
3、1％Triton X一100，用M一缓冲液配。
4、0.2％考马斯亮蓝R250，其溶剂是甲醇46.5ml，冰乙酸7ml，蒸馏水46.5ml。 5、3％戊二醛，用6m mol／L磷酸缓冲液(PH6．8)配制。 6、5％、7％、95％乙醇。
7、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、树胶。 (三)材料：洋葱鳞茎。
四、实验方法：
(一)取洋葱鳞茎内表皮细胞(约lcm2大小)若干片温于装有PH6．8磷酸缓冲液
的50ml烧杯中，使其下沉。
(二)吸去磷酸缓冲液，用1％Triton X一100处理20—30分钟。 (三)吸去Triton X—loo，用M一缓冲液洗3次，，每次10分钟。 ． (四)3％戊二醛固定0.5—1小时，(对照组开始处理)。 (五)PH6.8磷酸缓冲液洗3次，每次10分钟。 (六)用0．2％考马斯亮蓝R250染色20—30分钟。
(七)用蒸馏水洗1—2次，材料置于载玻片上，加盖玻片，即可镜检。
(八)如作永久制片，可使样品，顺序通过如下试剂：50％乙醇，70％乙醇。95％
乙醇，95％乙醇和叔丁醇混合液(1：1)，每次5一10分钟，或正丁醇→正丁醇二→甲苯二→甲苯，每次5—10分钟。然后捞取样品，平展于载玻片上，中性树胶封固。
五、作业
I、比较对照组和处理组的细胞骨架结构有何不同？ 2、绘制细胞骨架图。
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实验六 胞间连丝的观察
一、实验目的：
观察植物细胞的胞间连丝，了解其意义。
二、实验原理：
高等植物细胞之间通过胞间连丝相互连接，完成植物细胞间的通讯连结，胞间连丝穿越细胞壁，由相互连接的相邻的细胞质膜共同组成的直径为20—40nm的管状结构，中央是由内质网延伸形成的链管结构，胞间连丝的形成是在细胞分裂时由GB内质网小泡形成胞间层，内质网穿过胞间层形成胞间连丝，在细胞生长过程中胞间连丝的数目还会增加。
三、实验用品:
(一)器材：显微镜，载玻片，盖玻片，解剖刀，刀片，镊子，剪刀。 (二)试剂：0.5％的蕃红水溶液。
(三)材料：红辣椒，玉米籽粒，洋葱。
四、实验方法:
(一)红辣椒表皮细胞临时制片。
取一小块红辣椒，用刀片小心刮除果肉，留下一层极薄的表皮，放于载玻片上，封片观察、镜检时光线不要太亮。 （二）玉米种子糊粉层临时制片
将玉米种子在水中浸泡一天，用镊子剥去表皮露出糊粉层，这时可以用摄子轻撕糊 粉层放于水中，或制作徒手切片。刀口与糊粉层平行，切极薄片，封片观察。 (三)洋葱内表皮细胞观察
撕洋葱内表皮一小块，0.5％番红染色2—3分钟，冲洗，封片观察，多余的水用 吸水纸吸干。
五、作业
绘各种材料的胞间连丝图。
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