必然存在其他保护作用机理。表面张力减小的机理可以用于解释表面活性剂对蛋白质溶液冻结过程的保护。限制蛋白质分子扩散的机理认为，许多保护剂都能够提高溶液的粘度，抑制活性分子的扩散。
（二）干燥过程中的保护机理
玻璃态假说 在含有保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂不发生结晶时，保护剂与活性组分混合物就会形成玻璃态。玻璃态分为两种即：强玻璃和弱玻璃。
在玻璃化转变温度以下进行降温，弱玻璃粘度的增加，比强玻璃来的快。因此，赋形剂形成弱玻璃要比形成强玻璃的保护效果好得多。蔗糖和海藻糖就是因为能够形成一种弱玻璃而具有很好的保护作用。
水替代假说 由于蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子连接。当蛋白质在冷冻干燥过程中推动水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性。当冷冻干燥时，保护剂可与生物大分子的失水部位形成氢键，替代保持生物大分子冻干损伤。
（三）储藏过程中的保护机理
干燥过程中出现的引起蛋白质变质的时间尺度为小时，而对于储藏而言，时间尺度为月或年。在正确的冷冻干燥工艺中，要求产品温度接近于其玻璃化转变温度，而在正确的储藏条件下，环境温度应当比其玻璃化转变温度低得多，以获得很长的松驰时间。
三、耐热冻干保护剂配方需要注意的问题
确定最优的pH值 生物制品中的活性成分（如蛋白质）只有在很小的PH值范围内才是稳定的，并且不同的PH环境会影响蛋白质的溶解性。最优的PH环境有利于蛋白质的稳定性和它在溶液中的溶解性，冷冻干燥配方的PH对冻干生物制品长期储藏的稳定性也会带来很大影响。另外，酸碱度会影响固体状态下蛋白质的物理和化学的稳定性。
缓冲剂的选择 许多缓冲剂能够用于生物制品耐热保护剂配方中，但是并非每一种缓冲剂都能够用于任何溶液；对PH值敏感的蛋白质溶液，就应当避免使用磷酸钠缓冲液，这是由于在冻结过程中，Na2HPO4易于优先结晶，使得溶液的PH降低，最终引起蛋白质变性；正确选择缓冲剂的浓度也是很重要的。
填充剂的选择 填充剂有相当好的溶解性，与生物制品中活性组分相容，没有或者只有很小的毒性，具有较高的共晶温度。
低温、干燥保护剂的选择 糖类是生物制品冷冻干燥过程中使用最频繁的保护剂，一般不选用还原性糖，因为它可能与蛋白质之间发生非酶褐变反应；某些盐类也要用作生物制品在冷冻干燥过程中的保护剂；某些聚合物，因其能提高玻璃化转变温度，而常被用作保护剂。但是，聚合物与蛋白质分子形成氢键的能力远远低于糖类，所以常常采用聚合物和糖联合使用，当然，这种方式并不是对每一种蛋白质都是有效的。
超滤技术应用于穿琥宁冻干粉针的研究
【关键词】 超滤技术
【摘要】 目的 提高穿琥宁冻干粉针质量。方法采用“高纯度穿琥宁生产工艺”专利超滤技术生产穿琥宁冻干粉针并与其它厂家同类产品进行动物急性毒性试验比较。结果超滤技术生产的注射用穿琥宁ld50 明显高于其它厂家生产的同规格产品，单次静脉给药的ld50 达到910mg/kg，而国家标准说明书中的ld50 为675mg/kg，文献资料报道穿琥宁注射剂的单次静脉给药的ld50 为580～620mg/kg。结论超滤技术可以大大降低注射用穿琥宁产品的毒性，提高临床安全性。
注射用穿琥宁是采用爵床科植物穿心莲提取物―穿心莲内酯经酯化、脱水、成盐而制成的脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐，加入ph调节剂、碳酸氢钠等药用辅料经冷冻干燥而制成的供肌肉注射或静脉滴注用的无菌冻干粉针。用于病毒性肺炎、病毒性上呼吸道感染等。穿心莲性寒、味苦，能清热解毒，消炎止痛。可用于急性细菌性痢疾、急性胃肠炎、扁桃体炎、咽喉炎等。我国科研工作者于70年代初对穿心莲提取物成分进行了深入研究，结果表明，有效成分为其二萜类内酯化合物。因二萜类内酯化合物均难溶于水，无法满足临床需要，通过在内酯结构中引入不同的亲水基团，增加内酯的水溶性，目前已制成了多种穿心莲内酯针剂，穿琥宁即是抗炎解热作用最强者，目前在临床上已得到广泛应用，1992年被国家中医药管理局批准为全国中医院急诊科（室）首批必备中药之一。
我们通过北京图书馆对近年在医药刊物发表的有关穿琥宁86 篇论文进行分析，在24篇专题报道不良反应的文章中，除1篇只写“使用穿琥宁”外，其余23篇所报道的全部是水针剂。专家认为:穿琥宁水针剂不稳定，在室温条件下有效期为30.5天，因穿琥宁为一个二萜类内酯化合物，而且分子中有一共轭双键，因而化学活性高，易发生水解反应和氧化反应，生产中还要进行高温灭菌，这又促进了分解反应。纯净穿琥宁水溶液微黄略显绿色，但国内市场上穿琥宁水针剂的色泽深，有的甚至变成了黄色或棕黄色。穿琥宁水针剂的毒副反应主要为婴幼儿泄泻，发生率为22%;个别有白细胞锐减、过敏性休克、药疹、抽搐、瘙痒、高热、寒颤、呼吸困难、紫癜等。为了提高穿琥宁冻干粉针剂的质量，本试验研究了“高纯度穿琥宁生产工艺”专利超滤技术，应用于该产品生产并与其它厂家同类产品进行的动物急性毒性试验情况。 1 生产工艺
1.1 仪器 88-2型切向流超滤器，cl-25蠕动泵（军事医学科学院）;millipore超滤膜堆（截留分子量:5000）;lgj5型冷冻干燥机;西林瓶洗、烘、灌联动生产线。
1.2 药品与试剂穿琥宁（注射级，成都天台山制药有限公司）;碳酸氢钠（注射级，上海虹光化工厂）;右旋糖酐40（注射级，漯河华颖药业有限公司）;活性炭（针用，上海活性炭厂）;灭菌注射用水（本厂生产）;乙醇（药用，南阳天冠集团酒精厂）;盐酸、氢氧化钠均为分析纯试剂。
1.3 生产工艺（应用超滤技术）（1）在无菌室（百级）配料间内，将穿琥宁（原料药）溶于50%乙醇，
加0.5%～1%活性炭（注射级），在25～30℃温度下，用盐酸调ph为 6.5～6.7，搅拌30min，吸附原料在生产过程中因暴露空气而带进的热源物质，充分回流，使色泽下降两个色级;用分子截留量5000的超滤膜进行超滤，将5000以上分子量的大分子植物蛋白截留下来;超滤液经重结晶后用无热原注射用水淋洗、滤干，进入配料工序。（2）按千支计算，在无菌室（百级）配料间内，精密称取经计算后处方量的穿琥宁精制品，搅拌加入1.5%碳酸氢钠（注射级）溶液500ml，至溶解澄清;加10%右旋糖酐40（注射级）溶液 500ml，加无热原灭菌注射用水至3000ml，混合均匀，调ph至7.7±0.2。取半成品检验，定装量，除菌过滤后，冻干，封口即得。 2 急性毒性试验
根据国家药品监督管理局《化学药品和治疗用生物制品研究指导原则》中化学药品单次给药的毒性研究（即急性毒性试验）指导原则，对注射用穿琥宁进行了急性毒性试验，观察受试药物一次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况。 2.1 试验样品
2.1.1 注射用穿琥宁 我公司应用超滤技术试制生产的20020322，规格0.2g，微黄色冻干块状物。临用前以氯化钠注射液稀释至所需浓度。
2.1.2 注射用穿琥宁 我公司受黑龙江某制药公司委托加工生产的200101163批，规格0.2g，微黄色冻干块状物。临用前以氯化钠注射液稀释至所需浓度。
2.1.3 注射用穿琥宁 我公司在市场上购买的某制药公司生产的020503-1批，规格0.2g，微黄色冻干块状物。临用前以氯化钠注射液稀释至所需浓度。
2.2 试验动物 昆明种小鼠，购自河南省实验动物中心，合格证号:医动字第99012号。动物饲料购自河南省实验动物中心，为标准颗粒饲料。
2.3 试验方法与结果（1）试验室温度（:20±1）℃。（2）在预试验的基础上取健康小鼠180只，体重（19.0±2.0）g。雌雄各半，每个批号药物随机分为6组，每组10只。高低剂量的比值设定为1:0.9。根据预试验的结果，将受试药物配制成不同浓度，20020322批号为45.00、40.50、36.50、32.80、29.50、26.60mg/ml;200101163批号为45.00、40.50、36.45、 32.81、29.52、26.57、23.91mg/ml;020503-1批号为44.55、40.10、36.09、32.48、29.23、 26.31g/ml，静脉给药，体积为0.25ml/10g体重，给药速度为5s，给药后即刻观察，记录动物的反应和死亡情况。给药后自高剂量组开始，部分动物出现静伏少动、抽搐、四肢瘫软等现象，并呈抑制状态死亡，动物可随受试药物浓度的不同，出现的反应程度和死亡时间不同。死亡多发生在给药后的 30min～48h内，对死亡鼠立即进行尸检，肉眼观察各主要脏器，未见明显异常。对各组存活鼠逐日观察1星期，动物的外观行为、食欲、粪便未见明显异常，试验结束时，存活动物体重分别增长至（25.3±2.7）、（26.1±3.4）、（27.2±3.8）g。实验结果用bliss机率单位计算ld 50 值及可信限，结果见表1、2、3。测得注射用穿琥宁静脉给予小鼠的ld 50 值分别为:批号20020322为910.16mg/kg，其95%可信限为834.84～992.27mg/kg;批号20010163为 804.10mg/kg，其95%可信限为748.51～863.82mg/kg;批号020503-1为820.70mg/kg，其95%可信限为 758.94～887.49mg/kg。
3 讨论
采用超滤技术生产的注射用穿琥宁ld 50 明显高于其它厂家生产的同规格产品，单次静脉给药的ld
50达到
910mg/kg，而国家标准说明书中的ld 50为675mg/kg［8］，文献资料报道穿琥宁注射剂的单次静
脉给药的ld50达到580～620mg/kg［2］，因此，大大降低了注射用穿琥宁产品的毒性，提高了本品在临床上使用的安全性。