实验四 蛋白质的测定——凯氏定氮法
实验目的：1.掌握湿法消化的方法。
2.学会凯氏定氮法测蛋白质的原理和方法。
实验原理：蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使
蛋白质分解。分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离。用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
其反应如下：
（1）消化：样品与硫酸一同加热消化，硫酸使有机物脱水，破坏有机物，有机
物中的碳和氢，氧化为二氧化碳和水逸出，而蛋白质分解为氨，则与硫酸结合成硫酸铵留在酸性溶液中。
?H2SO4???SO2?H2O?[O]
2CH3?CH?NH2COOH?2[O]?2CH3?CHOH?NH2?2CO2 2CH3?CHOH?NH2?10[O]?4CO2?2NH3?4H2O
2NH3?H2SO4?(NH4)2SO4
在消化过程中，添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，温度可达400℃，加快了整个反应过程。其理由是随着消化过程硫酸的不断分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机物的分解。
K2SO4?H2SO4?2KHSO4 2KHSO4?K2SO4?H2O?SO3
但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。
(NH4)2SO4?NH3?(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4?2NH3?2SO3?2H2O
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为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂。但为了防止污染，通常使用硫酸铜。
?2CuSO4???Cu2SO4?SO2?O2
有机物分解的 C?O2?CO2
C?2CuSO4?Cu2SO4?SO2?CO2 Cu2SO4?2H2SO4?2CuSO4?2H2O?SO2
如在消化过程中，不易得到澄清溶液时，可将定氮瓶取下，放冷后缓慢加入30%过氧化氢2～3mL，促进消化。不要加入过氯酸，以免生成氮的氧化物损失，使结果偏低。所以，有机物全部消化后，出现硫酸铜的蓝绿色，它具有催化功能，还可以作为酸碱反应指示剂。
（2）、蒸馏：样液中的硫酸铵在氢氧化钠强碱性条件下，释放出游离氨，蒸馏用
0.05mol/LH2SO4溶液吸收。在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出，其反应式如下：
?2(NH4)2SO4?2NaOH???Na2SO4?2NH3?H2O
2NH3?H2SO4???(NH4)2SO4
加入40%氢氧化钠是否足量，可借硫酸在碱性条件下生成的褐色（Cu2O）沉淀，或深兰色的铜氨配离子指示。若溶液的颜色不改变， 则说明所加的碱液不足。
（3）、滴定：过剩的硫酸用氢氧化钠标准溶液滴定而求得氨含量，其反应如下：
H2SO4?2NaOH???Na2SO4?2H2O
实验试剂：①奶粉 ②浓硫酸
③40%氢氧化钠溶液：称取400克氢氧化钠，用水溶解并定容至1000
毫升。
④0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4克氢氧化钠，用水溶解并定容至
1000毫升。
⑤甲基红指示剂：溶解甲基红粉末0.1克于100毫升95%乙醇中。 ⑥混合指示剂：4份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基兰乙醇
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溶液临用时混合。
或：5体积溴甲酚绿（0.2%）与1体积甲基红（0.2%）混合。
⑦催化剂：硫酸铜:硫酸钾=1:10（W/W）
⑧0.05mol/L硫酸：量取2.8毫升浓硫酸，用水稀释至1000毫升。 或吸取20毫升0.01mol/L盐酸溶液，置于100毫升三角瓶中，加2滴0.5%酚酞指示剂，用已标定过的0.01mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色。（用标过盐酸做吸收液）。
实验仪器：凯氏定氮装置；分析天平；容量瓶；台秤；量筒；锥形瓶；移液管；
滴定管。
实验步骤：
（1）消化：精密称取固体样品1.5克，置于干燥的定氮瓶中，加入0.5克催化剂，
再加入20毫升浓硫酸，轻轻摇匀后，在通风橱中，将瓶以45°斜支于有小孔的石棉网上，小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力。升高温度，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时，取下放冷，用蒸馏水将消化液无损地洗入50毫升容量瓶内，稀释至刻度。混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法作试剂空白试验。
（2）蒸馏：装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示
剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入少量沸石以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水，使蒸气充分洗涤仪器，并检查仪器是否正确。取100毫升锥形瓶1只，先按一般方法洗净，再用水蒸气洗数分钟，冷却。用移液管加入0.05mol/L硫酸溶液15毫升及混合指示剂4滴，盖好表面皿备用。
使冷凝管下端插入液面下，吸取10mL样品消化稀释液，由小玻璃杯流入反应室，并以10mL水洗涤小玻璃杯使流入反应室内。塞紧小玻璃杯的棒状玻塞，将10mL40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻塞使其缓慢流入反应室，立即将玻塞塞紧，并加入水于小玻杯以防漏气，夹紧螺旋夹子，开始蒸馏。蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸
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馏1min，然后用少量水洗涤冷凝管下端外部。
（3）、滴定：全部蒸馏完毕后，用标准的0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定锥形瓶中
过剩的硫酸。当混合指示剂刚刚变为灰色或绿色时，即为滴定终点。
数据处理及结果计算：X?(V1?V2)?2C?0.014?F?100
10m?50其中：X——样品中蛋白质的含量%；
V1——样品消耗硫酸（或盐酸）标准液的体积，mL； V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸盐酸标准液的体积，mL； C——硫酸（盐酸不乘2）标准溶液的浓度；
0.014——0.5mol/L硫酸或1mol/L盐酸标准溶液1mL相当于氮的克数。 F——氮换算为蛋白质的系数，乳制品为6.38，面粉为5.70，大豆制品5.71。 m——样品质量，克（毫升）。
说明：（1）食品中的氮素化合物不完全是蛋白质，还有一些含氮的物质称为非蛋
白质，如叶绿素氮、尿素氮、游离氨氮、生物碱氮、无机盐等。故将凯氏定氮法计算所得的蛋白质称做粗蛋白。
（2）消化时采用长颈圆底凯氏烧瓶，斜支于电炉上在通风橱中进行，并使
全部样品浸泡在消化液中，防止样品粘附瓶颈上部，致使消化不完全。
（3）在消化过程中样品炭化使样品变黑，产生泡沫，这时要减小火力，勿
使黑色物质上升到凯氏瓶颈部，待消化液均匀沸腾后，再加大火力，直至消化液黄色消失呈淡兰色透明为止。
（4）蒸馏时，蒸气发生均匀，充足，蒸馏中途不得停火断气，否则发生倒
吸，加碱要足量，动作要快，防止氨损失。冷凝管出口一定要浸入吸收瓶中，防止氨挥发损失。蒸馏结束后，应先将吸收液离开冷凝管口，以免发生倒吸。蒸馏是否完全，可用精密pH试纸测试冷凝管口的冷凝液来确定。
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