内部氨基修饰
主要用C6-dT aminolinker来加到胸腺嘧啶残基上来进行内部修饰。修饰后氨基与主链相距10个原子距离，可用于进一步的标记和酶连接（如碱性磷酸酶），目前提供内部氨基修饰介导的dT-Dabcyl、dT-Biotin和dT-Digoxingenin 修饰。 可用于制备功能化的寡核苷酸，广泛应用在DNA芯片（DNA Microarray）和多重标记诊断系统。目前提供5' C6 氨基修饰和5' C12氨基修饰两种，前者可用于连接一些即便靠近寡核苷酸也不会影响其功能的化合物，后者用于亲和纯化基团的连接和一些荧光标记，尤其是当荧光可能会因标记太靠近DNA链而被淬灭时。
目前提供3' C6 氨基修饰。它可用于设计新的诊断探针和反义核苷酸，例如5'端可用高度敏感的32P或荧光素标记的同时3'可用氨基修饰以进行其他的连接。此外，3'修饰可以抑制3'外切酶酶解，从而可用于反义实验。
5'-巯基在很多方面与氨基修饰类似。巯基可用于加附各种修饰如荧光标记物和生物素。例如可以在碘乙酸和马来酰亚胺衍生物存在下来制作巯基连接的荧光探针。5'的巯基修饰主要用5'巯基修饰单体（5'-Thiol-Modifier C6-CE Phosphoramidite 或Thiol-Modifier C6 S-S CE Phosphoramidite）。用
5'-Thiol-Modifier C6-CE单体修饰后必须进行硝酸银氧化以去除保护基（trityl），而Thiol-Modifier C6 S-S CE单体修饰后须用DTT将二硫键还原成巯基。
Spacer 可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。C3 spacer 主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。3'-Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。 Spacer 18 常用于引进一个强疏水基团。
5'氨基修饰
3'氨基修饰
巯基（Thiol）
间臂（Spacer）
硫代修饰的寡核苷酸主要用于反义实验中防止被核酸酶降解。您
硫代可以选择全硫代，但随着硫代碱基的增加，寡核苷酸的Tm值会（Phosphorthioate） 降低，为了降低这种这种影响，可以对引物两端2-5个碱基进行
硫代修饰，通常可以选择5'和3'各3个碱基进行硫代修饰。 脱氧脲嘧啶可以插进寡核苷酸来增加双链的熔点温度从而增长双
脱氧脲嘧啶
链的稳定性。每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧脲嘧啶替代可以增长双链
（DeoxyUridine，dU）
熔点温度1.7 ℃。 脱氧次黄嘌呤是一个自然存在的碱基，虽然不是真正意义上的通用碱基，但当与其它碱基结合时，会比其它碱基错配相对更稳定。
脱氧次黄嘌呤
脱氧次黄嘌呤与其它碱基的结合能力为dI:dC > dI:dA >
（deoxyInosine，dI）
dI:dG > dI:dT. 在DNA聚合酶的催化下，脱氧次黄嘌呤首选与dC结合。 35. 为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?
主要因为是修饰单体稳定性较差，偶联时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。 36. 合成的荧光标记探针应如何保存?
荧光探针保存方法如下： 1) 荧光探针必须避光保存。
2) 干品可于-80℃保存一年以上,如无条件，请于-20℃保存。
3) 强烈建议用RNase-free的TE (pH 8.0) buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。通常，将探针配制成100 pmol/μl的储备液，分装成几份 (每份最多反复冻融5次)，于-20 ℃保存。使用前，将配制好的储备液稀释成工作液 (10 pmol/μl或20 pmol/μl)，剩余部分于-20 ℃保存。 37. 常见的荧光染料有哪些？ 荧光染料参数 缩写 TET HEX ROX Cy3 Cy5
全名
5-tetrachloro-fluorescein 5-hexachloro-fluorescein 6-carboxy-x-rhodamine Indodicarbocyanine Indodicarbocyanine
吸收波长 发射波长 颜色 494 nm 518 nm Green 521 nm 538 nm Orange 535 nm 553 nm Pink 560 nm 582 nm Rose 587 nm 607 nm Red 552 nm 570 nm Red 643 nm 667 nm Violet
6-FAM 6-carboxy-fluorescein
TAMRA tetramethyl-6-carboxyrhodamine
38. 5-FAM、6-FAM、FITC标记之间有何区别?
5-FAM、6-FAM、FITC标记都是荧光素标记 (Fluorescein)，5-FAM与6-FAM互为异构体；而FITC则在与Oligo的连接方式上(硫脲键) 有别于前两者(酰胺键)，但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。
39. 淬灭基团为TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的双标记荧光探针在使用上有什么不同?
由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes)，或称TaqMan探针，用于实时荧光定量PCR实验。
1) TAMRA为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，会在更高波长处发射荧光。而Eclipse及BHQ系列为非荧光染料，淬灭报告基团时，自身不发射荧光，探针荧光本底比TAMRA低，检测灵敏度更高。
2) TAMRA的吸收光谱覆盖范围窄，可与之匹配的报告基团种类比较少；而Eclipse则具有更宽的吸收范围(390 nm-625 nm)，可淬灭的报告基团种类很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；组合使用的BHQ系列染料的吸收光谱覆盖范围则更广，从430 nm
一直到近红外，可淬灭的报告基团种类更多，包括Cy3、Cy5等。因此可由Eclipse或BHQ系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重PCR。 40. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？
下列原则可供您参考：
1) TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150 bp），但不能与引物重叠。 2) 长度一般为18-40 mer 。
3) G-C含量控制在40-80%左右。
4) 避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 5) 在引物的5’端避免使用G。 6) 选用比较多的碱基C。
7) 退火温度Tm控制在 68-70 ℃左右。