环境工程微生物学实验技术
肉膏蛋白胨培养液、大肠杆菌菌种及大肠杆菌8h和14h的培养物 3、其他
试管、锥形瓶、移液管 四、实验基本要求
1、实验课前需对实验内容进行预习。 2、对分光光度计的使用要注意操作规程。 五、实验报告要求
1、结合本教材及实验课所学内容，写出实验报告。
2、实验报告内容包括实验原理、实验目的、实验器材、实验步骤、结果讨论等。
3、记录所测定的OD420值数据。
4、以OD420值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘出两种培养条件下的大肠杆菌生长曲线。
5、由生长曲线得出大肠杆菌的生长周期，分析生长周期对大肠杆菌生长的指示作用。
思考题：
1、补充哪些实验，可以通过测定OD值便可知样品的活菌数？ 2、比较两条生长曲线有何差异？为什么？ 3、在测定过程中，哪些操作易造成较大误差？ 六、相关基础知识
参考教材《环境工程微生物学实验技术》、《环境工程微生物学》和《环境微生物学》。
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实验六：水的微生物学检查
一、实验目的
1、学习并掌握饮用水质的细菌学检测方法。
2、了解水质状况与细菌数量及大肠菌群的数量在饮用水中的重要性。 二、实验内容与方案
1、基本原理
饮水是否合乎卫生标准，需要进行水中的细菌数量及大肠菌群数的测定。细菌总数的测定采用平板培养菌落计数法，大肠菌群数的测定是将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应结果，确证大肠菌群的阳性管数后，在检索表中查出大肠菌群的近似值。
我国饮用水标准：1ml自来水中细菌总数不得超过100个；1L自来水中大肠菌群数不得超过3个。
2、水样来源
（1）学校水源 各深水井泵房取样。 （2）食堂及各生活区自来水样。
取样方法：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，并点燃火焰灭菌，打开水龙头放水1~2min，用无菌空锥形瓶接取水样约350ml。
3、细菌总数测定
用无菌移液管分别吸取1ml水样，加入培养皿中（每个水样平行做三个培养皿），每个培养皿各加入12ml左右已融化并冷至45~50℃的肉膏蛋白胨培养基，迅速轻轻旋转摇动，使水样与培养基充分混匀。待凝固后，将平板倒置于37℃恒温箱内培养24h，进行菌落计数。
4、用发酵法检查大肠菌群 （1）初发酵试验
取2个装有50ml三倍乳糖蛋白胨培养基的大发酵管，在无菌操作条件下各加入100ml水样，混匀。另取10支装有5ml三倍乳糖蛋白胨发酵管，用无菌移液管各加入10ml水样，混匀后37℃培养24h。若培养后无反应，说明水质中无大肠菌群存在（需用300ml的水样检测大肠菌群）。
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（2）固体培养
若出现反应，将产酸、产气及只产酸的发酵管进行平板分离。分别用接种环取发酵液划线接种于伊红美蓝培养基平板上，于37℃培养18~24h。将出现以下三种特征的菌落，进行涂片、革兰氏染色、镜检。
具金属光泽、深紫色菌落； 紫黑色、微或无金属光泽的菌落； 淡黑色、中心紫色的菌落。 （3）复发酵试验
若镜检为革兰氏阴性、无芽孢杆菌，挑取此菌落的一部分，接种于乳糖蛋白胨发酵管中，经37℃培养24h，结果若产酸产气，即证实有大肠菌群存在。
证实后，再根据发酵试验的阳性管数查表（表13-1-1）得出大肠菌群数的近似值。为保证人类的健康，1L饮用水检测出的大肠菌群书不应超过3个。若大肠菌群数超标，说明此水质被污染，应进一步查出污染原因。
饮用水大肠菌群检测步骤总结如下： 初发酵：三倍乳糖发酵液 选择三种菌落作涂片，革兰氏染色，镜检
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水样 (1)50ml/瓶+100ml水样2瓶 (2)5ml/管+10ml水样10支试管 37℃ 24h 从“⊕”及“+”发酵管中取样 在EMB平板培养基上划线分离 37℃ 18~24h 1.深紫黑色，具金属光泽 2.紫黑色，微或无金属光泽 3.淡紫红色，中心较深 复发酵：选G—无芽孢杆菌的菌落一部分接种于普通乳糖发酵管 37℃ 24h 若结果为“⊕”查表计数 环境工程微生物学实验技术 表6-1 大肠菌群检数表﹡
100ml水量的阳性管数 0 1 2 10 ml水量的阳性管数 1L水样中大肠菌群数 1L水样中大肠菌群数 1L水样中大肠菌群数 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ﹤3 3 7 11 14 18 22 27 31 36 40 4 8 13 18 24 30 36 43 51 60 69 11 18 27 38 52 70 92 120 161 230 ﹥230 ﹡接种水样总量为300ml，其中100ml 2个水样，10ml 10个水样。
若证实有大肠菌群存在，根据阳性管数查表即得出1L水样中大肠菌群数。 三、实验设备与材料（或样品）
1、水样
取深井中的水及生活中的自来水等均可。 2、培养基
肉膏蛋白胨培养基、乳糖蛋白胨培养基、三倍乳糖蛋白胨培养基、伊红美蓝培养基（附录二）
注：乳糖蛋白胨培养基中成分各按三倍量配制，蒸馏水仍为100ml，配方及配制方法见附录二。分别将乳糖蛋白胨培养基及三倍乳糖蛋白胨培养基分装于具有倒置杜氏小管的试管中，0.056MPa灭菌30min。
3、器皿
无菌空瓶（500ml锥形瓶）、无菌培养皿、移液管、试管锥形瓶等。 四、实验基本要求
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