环境工程微生物学实验技术
接种后，将平板倒置于30℃恒温箱中，培养2~3d观察结果。 2、划线分离法
菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。划线分离的培养基必须事先到好，需充分冷凝待平板稍干后放可适用；为方便划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种（如图4-2A、B）。连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种环上的菌；另一种是将平板分四区，故又称四分区划线法。划线时每次将平板转动60~70°划线，每换一次角度，应将接种环上的菌烧死后，再通过上次划线处划线。
图4-2 划线分离方式
1）连续划线法
以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落，将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种有菌的部位在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠（图4-3），划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温箱内培养（以免培养过程皿盖冷凝水滴下，冲散已分离的菌落）。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，图片镜检后再接种斜面。
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图4-3 划线分离示意图
2）分区划线法
取菌、接种、培养方法与―连续划线法‖相似。分区划线法分离时平板分四个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。先将接种环沾取少量菌在平板1区划3~5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60~70°，右手把接种环上多余菌体烧死，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60~70°，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。
本次实验在分离酵母菌的平板上选取单菌落，于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离，使菌进一步纯化。划线接种后的平板，倒置于30℃恒温箱中培养24h后观察结果。
三、实验设备与材料
1、菌源 选定采土果园后，铲去表土层2~3cm，取3~10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。
2、培养基 豆芽汁葡萄糖培养基（见附录二）。 3、无菌水或无菌生理盐水
配置生理盐水，分装于250ml锥形瓶，每瓶装99ml，每瓶内装10粒玻璃珠。分装试管、每管装4.5ml（每人5~7支）。
4、其他物品
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无菌培养基、无菌移液管、无菌玻璃涂棒（刮刀）、称量纸、药勺、橡皮头、10%酚溶液。 四、实验基本要求
1、实验课前需对实验内容进行预习，提前设计好实验方案。 2、实验过程中要注意无菌操作。
3、注意观察及记录实验现象，并在实验报告中有所体现。 五、实验报告要求
1、简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。 2、记录所分离的微生物平板菌落计数结果。 3、记录所分离样品中菌落的培养条件及菌苔特征。 思考题：
1、划线分离时为什么每次都要将接种环上多余菌体烧掉？划线时为何不能重叠？
2、在恒温箱中培养微生物时为何培养皿需倒置？
3、分离某类微生物时培养皿中出现其他类微生物，请说明原因？应该如何进一步分离和纯化？经过一次分离的菌种是否皆为纯种？若不纯，应采用哪种分离方法最合适？ 六、相关基础知识
主要参考教材《环境工程微生物学实验技术》、《环境工程微生物学》和《环境微生物学》。
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实验五：微生物生长量的测定和生长曲线绘制
一、实验目的
1、学习比浊法测定微生物的数量。 2、测定培养液中的大肠杆菌数量。
3、学习用比浊法测定大肠杆菌的生长曲线。 二、实验内容与方案
1、预先将大肠杆菌接种到肉膏蛋白胨培养液中，37℃振荡培养18h备用。 2、将紫外分光光度计的波长调整到420nm，开机预热10~15min
3、以未接种的肉膏蛋白胨培养液校正比色皿的零点（以后每次测定都要重新校正零点）。
4、将培养8h和14h的大肠杆菌液分别倒入相同类型的比色皿中，测定其OD值。若菌液浓度大，可适当进行稀释，使OD值得读数在0.0~0.4之间最好。
5、取盛有150ml无菌肉膏蛋白胨培养液的500ml锥形瓶6个，分为两组，分别编号为1、2、3号和4、5、6号。各瓶加入培养18h的大肠杆菌培养液10ml，37℃下振荡培养。
6、于接种后的第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20h，分别用无菌移液管从各瓶中吸取培养液5ml，在分光光度计上测定OD420值。若菌液太浓时，作适当稀释，使OD420值在0.0~0.4之间较好。经稀释后测得OD420值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD420值。
7、于培养第8h取样测定后，向其中一组（1~3号）每瓶加入肉膏蛋白胨培养液的5倍浓缩液10ml作补料；另一组（4~6号）每瓶加入10ml无菌水。继续振荡培养和测定。
6、测定后把比色皿中的菌液倾入容器中，用水冲洗比色皿，冲洗水也收集于容器中进行灭菌。最后用70%酒精冲洗比色皿。 三、实验设备与材料
1、仪器
722紫外分光光度计 2、培养基和菌种
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