环境工程微生物学实验技术
取出目镜测微尺镜头，换上原目镜，再将目镜测微尺和物镜测微尺擦拭干净包好归还。
三、实验设备与材料
1、菌种：啤酒酵母。
2、器材：显微镜、目镜测微尺镜头、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、试管、无菌水。 四、实验基本要求
1、观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度；换高倍镜或油镜校正时，务必小心，防止物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。
2、换不同物镜或目镜要重新标定目镜测微尺和物镜测微尺。
3、将稀释到适宜浓度的少量酵母菌培养液涂在载玻片而不是镜台测微尺上。 五、实验报告要求
1、目镜测微尺标定结果（准确到零点几小格）（表3-1）
物镜倍数 目镜(10×) 40× 目镜测微尺格数(小格) 镜台测微尺格数(小格) 目镜测微尺每格长度(μm) 2、酵母菌大小测定结果（表3-2）
表3-2 酵母菌大小测定结果
菌号 目镜测微尺格数(长 轴)(小格后估计一位) 目镜测微尺格数(短轴) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 菌号 目镜测微尺格数(长 轴)(小格后估计一位) 目镜测微尺格数(短轴) 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 酵母长轴平均值(μm)=±(保留小数点后2位) 酵母短轴平均值(μm)=±(保留小数点后2位)
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思考题：
1、为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行标定？
2、不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一菌体大小时，其测定结果是否相同？为什么？ 六、相关基础知识
1、应在《环境工程微生物学》课堂教学基础上进行本实验的实践教学。 2、参考教材《环境工程微生物学实验技术》、《环境工程微生物学》和《环境微生物学》。
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2 平板菌落计数法
一、实验目的
1、了解利用平板菌落计数法测定微生物样品中活细胞的原理。 2、熟练掌握平板菌落计数的操作步骤与方法。 二、实验内容与方案
1、平板菌落计数法原理
平板菌落计数法是一种应用广泛的测定微生物生长繁殖的方法，其特点是能测出微生物样品中的活细胞数，故又称活菌计数法。
本法的原理和操作要点是：先将待测定的微生物样品按比例地作一系列稀释（通常为10倍系列稀释法），再吸取一定量某几个稀释度的菌悬液于无菌培养皿中（或凝固的无菌平板培养基的表面），再及时倒入融化且冷却至45℃左右的培养基，立即充分摇匀，水平静置待凝（或用涂布棒将平板表面的菌液及时涂布均匀）。经培养后，将各平板中计得的菌落数的平均值换算成单位容积的含菌量，再乘以样品的稀释倍数，即可测知原是菌样的单位容积中所含的活细胞数。由于平板上的每一个单菌落都希望是从原始样品液中的各个单细胞（或孢子）的生长繁殖而形成的，因此，在菌样的测定中必须使样品中的细胞（或孢子）充分均匀地分散，且经适当地稀释，使每个平板上所形成的菌落数控制在适当的范围，一般细胞的平板菌落计数以30~300个为宜，这样可以减少计数与统计中的误差。
这种计数法的最大优点是能测出样品中的活菌数。此法还常用于微生物的选种与育种、分离纯化及其他方面的测定。缺点是操作手续较繁，时间较长，测定值常受各种因素的影响。
2、方法和步骤 1）融化培养基
先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基加热融化，并置50℃恒温水浴锅中保温备用。 2）编号
取6~8支无菌试管，依次编号为10-1，10-2，10-3，……. 10-6（或至10-8，视菌液浓度而定）；再取10套无菌培养皿，依次编号为10-4、10-5和10-6（或10-6、10-7和10-8），各稀释浓度做三个重复测定平板，留下1个平板作空白对照。
3）分类稀释液
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以无菌操作法用5ml移液管分别精确吸取4.5ml无菌的生理盐水与上述各编号的试管中。
4）稀释菌液
每次稀释待测菌的原始样品时，先将其充分摇匀。然后用1ml无菌移液管在待稀释的原始样品中来回吹吸数次（注意：吹出菌液时，移液管尖端必须离开菌液的液面），再精确移取0.5ml菌液至10-1的试管中（注意：这根已接触过原始菌液样品的移液管的尖端不能再接触试管10-1的菌液液面）。然后领取1ml无菌移液管，以同样的方式，现在10-1试管中来回吹吸样品数次，并精确移取0.5ml菌液至的10-2试管中，如此稀释至10-6（或10-8）为止。整个稀释流程如图3-4所示：
3-4 平板菌落计数法操作过程示意图
5）转移菌液
分别用1ml无菌移液管精确吸取10-4、10-5、10-6稀释菌液各0.2ml，加至相应编号的无菌培养皿中。
6）倒培养基液
菌液移入培养皿后应立即倒上融化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒入量12~15ml）。
7）摇匀平板
摇匀平板菌液与培养基方式如图3-5所示，即将含菌悬液与融化琼脂培养基液的平板快速地前后、左右轻轻地倾斜晃动或以顺时针和逆时针方向使培养液旋转摇匀，使待测定的细胞能均匀地分布在平板的培养基内，培养后的菌落能均匀
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