环境工程微生物学实验技术
1）涂片 取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌制成涂片，干燥、固定。
2）染色 用草酸铵结晶紫染液染色1min，用水冲洗。
3）媒染 滴加革氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，用水冲去碘液。 4）乙醇脱色 斜置载片与一烧杯上，滴加95%乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约0.5min）。立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被污染为阳性菌。
5）复染 蕃红染液复染1min，水洗。
6）吸干并镜检 若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作为对照。 三、实验设备与材料
1、菌种 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和草分歧杆菌（培养18~24h的斜面菌种各一支，前三种菌培养好的菌落平板各一个）。
2、染液 草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液。
3、其他物品 无菌水、显微镜、载片、滤纸、液体石蜡、擦镜纸、接种环。四、实验基本要求
1、观察大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的菌落特征。 2、以革兰氏染色法观察大肠杆菌及金黄色葡萄球菌。 3、用革兰氏染色法鉴别几种细菌。 五、实验报告要求
1、描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌菌落特征（包括形状大小、色泽、透明度、边缘和表面隆起形状）。
2、绘图：画出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞形态图。 3、记录三种菌的革兰氏染色结果；分辨出革兰氏阳性菌或阴性菌。如果染色结果不理想，请分析原因。
思考题：
1、什么是低倍镜、高倍镜及油镜，各放大多大范围？油镜最小可观察多大的物体？为什么细菌要用油镜观察？
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2、要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作？哪一步是关键步骤？为什么？
3、当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠？ 4、为什么要染色？直接观察岂不省事吗？ 5、固定后细菌是死的还是活的？ 六、相关基础知识
1、应在《环境工程微生物学》课堂教学基础上进行本实验的实践教学。 2、参考资料为《环境工程微生物学实验技术》、《环境工程微生物学》和《环境微生物学》。
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实验三：微生物的数量及大小的测定
1 酵母菌大小测定
一、实验目的
学习并掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法。 二、实验内容与方案
1、实验原理
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺（包括目镜测微尺和镜台测微尺）完成。
目镜测微尺（图3-1）是一块放入目镜中的圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等份，或把10mm刻成100等份，用于测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目测测微尺每小格所代表的实际长度。然后根据微生物细胞相对于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。
图3-1 目镜测微尺
镜台测微尺（图3-2）是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般是将1mm等分为100格，每格为0.01mm（10μm），是专门用来校正目镜测微尺的。
图3-2 镜台测微尺
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2、目镜测微尺的校正
取下原显微镜上的右侧目镜，将装有目镜测微尺的目镜装上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，利用镜台移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数（见图3-3）。用同样的方法换成高倍镜进行校正。目镜测微尺和镜台测微尺校正时与以前物理实验中用到的游标卡尺的使用类似。
图3-3 目镜测微尺的校正
已知镜台测微尺每格10μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度。
目镜测微尺每格长度（μm）=两重合线间镜台测微尺格数×10/两重合线间目镜测微尺格数
例如，重合两处之间目镜测微尺有50小格而物镜测微尺有68小格，则目镜测微尺每格长度为68×10/50=13.6（μm）。
3、细胞大小的测定
先将镜台测微尺取下，将稀释到适宜浓度的少量酵母菌培养液涂在载玻片（不是镜台测微尺）上，盖上盖玻片，放在载物台上先用低倍镜找到目的物，再用高倍镜观察，观察时可转动目镜，使目镜测微尺位于酵母细胞的长轴或短轴上，用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘以目镜测微尺每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。注意选取各种大小的菌体进行测量，不能只挑大的细胞测量。
4、测定完毕
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