环境工程微生物学实验技术

论等。

思考题

（1）请分析肉膏蛋白胨琼脂培养基中各成分的作用？这种培养基的营养及pH适于哪种微生物生长？

（2）为什么配培养基加蒸馏水？自来水中盐类多，营养成分比蒸馏水丰富，是否可用自来水配培养基？

（3）棉塞太松、太紧有什么影响？吸管为什么要堵棉花？不堵行不行？为什么？要这么复杂包装？少包点行不行？

（4）高压蒸汽灭菌注意点及操作。

（5）1㎏/㎝2高压蒸汽灭菌的温度是多少？玻璃器皿应灭菌多长时间？ 六、相关基础知识

1、应在《环境工程微生物学》课堂教学基础上进行本实验的实践教学。 2、参考书为《环境工程微生物学实验技术》、《环境工程微生物学》和《环境微生物学》。

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实验二：细菌的形态和结构观察

一、实验目的

1、观察细菌菌落的特征。

2、掌握简单染色法、革兰氏染色法的原理及操作步骤 3、在油境下观察细菌个体的形态。

4、学习环境中微生物的检查方法，并加深对微生物分布广泛性的认识。 二、实验内容与方案

1、实验室环境内微生物的检查

预先制备肉膏蛋白胨培养基平板，培养基底部用红蜡笔划分为几个区域，分别用手指、钱币等轻轻在平板培养基上涂抹。如要检查空气中的微生物时，则将平板的培养皿的皿盖打开，在空气中暴露5~10min，再盖上皿盖，37℃培养24~28h观察结果。

2、观察平板上的细菌菌落，识别大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌菌落特征

注意菌落的形状、高度、大小、颜色，是否湿润、光泽、透明度、边缘状况等等（图2-1）

A.菌落的形态及边缘 1.圆形，边缘整齐；2.不规则状；3.边缘波状；4.边缘锯齿状；5.

同心圆状；6.边缘缺刻状；7.丝状；8.假根状

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B.菌落的表面形态 1.扁平、扩展；2.低凸面；3.高凸面；4.台状；5.脐状；6.突脐状；

7.乳头状；8.褶皱凸面 图2-1 细菌菌落特征

3、简单染色步骤 1）涂片

取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴无菌水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体(无菌操作，见附录四斜面接种)与水混合。烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径约1cm的均匀薄层。制片是染色的关键，载片要洁净，不得沾污油脂，菌体才能涂布均匀。注意初次涂片，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。

2）干燥 涂布后，待其自然干燥。

3）固定 将已干燥的涂片标本向上，在微火上通过3~4次进行固定。固定的作用为：（1）杀死细菌；（2）使菌体蛋白质凝固，菌体牢固粘附于载片上，染色时不被染液或水冲掉；（3）增加菌体对燃料的结合力，使涂片易着色。

4）染色 在涂片处滴加草酸铵结晶紫溶液1~2滴，使其布满涂菌部分，染色1min。

5）冲洗 斜置载片，倾去染液。用水轻轻冲去染液，至流水变清。注意水流不得直接冲在涂菌处，以免将菌体冲掉。

6）吸干 用吸水纸轻轻吸去载片上的水分，干燥后镜检（染色过程见图2-2）

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图2-2 细菌染色标本制作及染色过程

1.取接种环；2.灼烧接种环；3.摇匀菌液；4.灼烧管口；5a.从菌液中取菌（或5b从斜面菌种中取菌）；6.取菌毕，再灼烧管口，加上塞；7a.将菌液直接涂片（或7b从斜面菌种中取菌与玻片上水滴混匀涂片）；8.烧去接种环上的残菌；9.固定；10.染色；11.水洗；12.吸干

7）镜检 将染色的标本，先用低倍镜找到目的物，将低倍接物镜转开，滴加一小滴液体石蜡于涂片处，用油镜进行观察。注意各种细菌的形状和细菌排列方式。观察完毕，用擦镜纸将镜头上的液体石蜡擦净。

4、革兰氏染色法

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