环境工程微生物学实验技术

⑸将粗调节器向下旋转，同时眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的下端距离载玻片约0.5㎝时即停止旋转；

⑹把粗调节器向上旋转，同时左眼向目镜里观察，如标本显出不清楚，可用细调节器调至标本完全清晰为止；

⑺假如因粗调节旋转太快，超过聚焦点，以致标本不出现时，不应在眼睛注视目镜的情况下向下旋转粗调节器，必须从第⑸步做起，以防物镜与载玻片接触，损坏物镜；

⑻在观察时最好练习两眼同时睁开，用左眼看显微镜，右眼看桌上的纸，便于一面看，一面画出所观察的物象。

高倍镜的使用方法如下：

⑴使用高倍镜前，先用低倍镜观察，要把观察的标本放到视野正中； ⑵拨动回转板使高倍镜和低倍镜两镜头互相对换，当高倍镜移向载玻片上方时必须注意是否因高倍镜靠近的缘故而使载玻片也随着移动，如有移动现象，应立即停止推动回转板，把高倍镜退回原处，再按照使用低倍镜的方法，校正标本的位置，然后旋转调节器，使镜筒稍微向上，再把高倍镜推至镜筒下；

⑶当高倍镜已被推到镜筒下面时，向镜内观察所显现的物象往往不清晰，这时可旋转细调节器至清楚为止。

油镜的使用方法如下：

⑴一般油镜头上有一白圈或红圈，有时标有―OI‖（Oil Immersion）或―HI‖字样。先用粗调节器将镜筒提起约2㎝，在载玻片上加一滴香柏油，拨动回转板使油镜在镜筒下方，然后小心的降下镜筒，使镜头尖端和油接触，注意镜头不能压在载玻片上，更不能用力过猛，否则压碎玻片或损坏镜头；

⑵向目镜内观察，如象不清晰，可稍微调节细调节器。若光线过暗，可调节反光镜；

⑶油镜使用完毕，必须用指定的长纤维脱脂棉或擦镜纸将油镜及载玻片所粘着的油拭净。必要时可蘸少许乙醇乙醚混合液擦拭镜头，最后用擦镜纸或软稠擦干。

2、活性污泥中生物相的观察

将提前培养好的活性污泥，用滴管取少量污泥滴在载玻片上，于显微镜下进

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行观察。注意选择合适放大倍数的物镜。记录污泥中微生物的形态，并与教材中的微生物类型进行比较和分析。 三、实验设备与材料

1、菌源

污水处理厂好氧曝气池活性污泥（提前曝气） 1、仪器 光学显微镜 2、其他

菌种，载玻片，压玻片，取菌液滴管，烧杯（废液杯），记号笔，擦镜纸，香柏油。

四、实验基本要求

1、实验课前需对实验内容进行预习，初步了解光学显微镜的简介。 2、掌握显微镜正确使用方法及注意事项。 3、学习如何制备微生物标本片。 3、描绘观测到的各种微生物的形状；

4）实验过程中要注意记录实验现象，并在实验报告中有所体现。 实验说明：相关微生物的种类和形态参见附录三。 五、实验报告要求

1、结合本教材及实验课所学内容，写出实验报告。

2、实验报告内容包括实验原理、实验目的、实验器材、实验步骤、结果讨论等。

3、根据污泥中各种微生物的种类，分析污水处理的效果。 思考题：

1、如何正确使用显微镜？应注意哪些地方？ 2、污水水质较好时的指示性微生物有哪些？ 六、相关基础知识

参考教材《环境工程微生物学实验技术》、《环境工程微生物学》和《环境微生物学》。

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实验八：含酚污水降解菌的分离、纯化与筛选（综合性试验）

一、实验目的

1、学习从含酚工业废水、活性污泥中筛选苯酚降解菌。 2、学习通过活性污泥培养驯化和分离耐酚菌。 二、实验内容与方案

1、采样

自焦化厂、钢铁公司化工厂处理含酚工业污水的曝气池中取活性污泥和含酚污水，装于无菌锥形瓶中，带回实验室。记录采样日期、地点、曝气池的水质分析（包括：挥发酚、可溴化物、BOD5(五日生化需氧量)、COD(化学需氧量)、焦油、硫化物、总氮、氨态氮、磷、pH、水温等）。采回的样品应迅速稀释分离。

2、梯度平板法分离纯化

一般微生物在含苯酚培养基上不能生长，苯酚耐受菌株的筛选，可采用与筛选药物抗性菌株一样的梯度平板法。即在培养基中加入一定量的药物，使大量细胞中的少数抗性菌细胞在平板的一定剂量药品的部位长成菌落，从而判定该菌株耐酚的能力。

1）梯度平板制备

在已灭过菌的培养皿中，先倾倒7~10ml不含苯酚的已灭过菌的细菌或真菌培养基，将培养皿一侧放置木条上，使皿中的培养基倾斜成斜面，而且刚好完全盖住培养皿底部，待培养基凝固后，将培养皿放平，再倾倒7~10ml已融化的无耐酚真菌培养基活或耐酚细菌培养基（苯酚终浓度为75mg/100ml），刚好完全盖住下层斜面，由于苯酚的扩散作用，上层培养基薄的部份苯酚浓度大大降低，造成上层培养基由厚到薄苯酚浓度递减的梯度（图8-1）。

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图8-1 梯度平板制备及菌落生长情况

2）涂布法分离

将采集的样品稀释涂布分离，30℃培养2d后，平板上生长的菌落也形成密度梯度，上层培养基薄的部份苯酚低浓度区形成菌苔较多，上层培养基厚的部份苯酚高浓度区出现稀少菌落。将此菌落在耐酚细菌培养及平板或耐酚真菌培养基平板上连续划线分离，最后挑取单菌落接种到耐酚斜面培养基上，30℃培养2d。

3、耐酚菌驯化

先将从含酚工业废水采集来的活性污泥，放入苯酚无机培养液中（苯酚终浓度25mg/L、MgSO4.7H20终浓度0.3%，KH2PO4终浓度0.3%），30℃振荡培养6~10d，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰对酚不适应的微生物；再添加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至100mg/L），30℃振荡培养4~6d；再流加苯酚无机培养液（苯酚终浓度增加至200mg/L）30℃振荡培养4~6d，再提高到流加250mg/L苯酚无机培养液，30℃培养4d后从中选出对苯酚耐受力强的苯酚降解菌。

4、性能测定 1）初筛

制备不同浓度苯酚含量的平板培养基（苯酚终浓度依次为：0.025%、0.045%、0.060%、0.075%），将选出的耐酚力强的菌株在其上分别划线分离，自高酚浓度平板上长出的菌落，即为苯酚降解力高的菌株。

2）复筛

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