环境工程微生物学实验技术

目 录

课程信息与实验时间安排............................................................................................ 1 实验一：微生物培养基的制备、灭菌及接种............................................................ 2 实验二：细菌的形态和结构观察.............................................................................. 13 实验三：微生物的数量及大小的测定...................................................................... 18 实验四：微生物的纯种分离...................................................................................... 27 实验五：微生物生长量的测定和生长曲线绘制...................................................... 31 实验六：水的微生物学检查...................................................................................... 33 实验七：污水处理水质指示性微生物观测.............................................................. 37 实验八：含酚污水降解菌的分离、纯化与筛选（综合性试验）.......................... 42 附录一 玻璃器皿的洗涤.......................................................................................... 46 附录二 培养基的配方.............................................................................................. 49 附录三 污水处理工程中常见的原生动物和后生动物.......................................... 57 附录四 实验常用试剂及溶液配制.......................................................................... 61

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环境工程微生物学实验技术

课程信息与实验时间安排

课程名称：环境工程微生物学实验 课程编号：01030L 课程类别：本科生必修 开课院系：土木与环境工程学院环境工程系 开课专业：环境工程 课内总学时：18 学分：2 实验学时：18 课内上机学时：0 课程负责人：林 海 先修课程：环境工程微生物学

实验时间安排

实验内容 实验一：微生物培养基的制备、灭菌及接种 实验二：细菌的形态和结构观察 实验三：微生物的数量及大小的测定 实验四：微生物的纯种分离 实验五：微生物生长量的测定和生长曲线绘制 实验六：水的微生物学检查 实验七：污水处理水质指示性微生物观测 实验八：含酚污水降解菌的分离、纯化与筛选（综合性试验） 学时数 2 2 2 2 2 2 2 4

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环境工程微生物学实验技术

实验一：微生物培养基的制备、灭菌及接种

一、实验目的

1、了解培养基配制的原理和培养基的种类。 2、掌握常规培养基配制程序。 3、了解高压蒸汽灭菌原理。 4、掌握高压蒸汽灭菌的操作。 5、掌握微生物接种技术。 二、实验内容与方案

1、基本原理

正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。

高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、以及外科手术器械等方面最常用的一种灭菌方法。一般培养基、玻璃器皿、无菌水、无菌缓冲液、金属用具、接种室的实验服及传染性标本等都可采用此法灭菌。

高压蒸汽灭菌是把待灭菌物品放在一个密封的高压蒸汽灭菌锅中，当锅内压力为0.1MPa时，温度可达到121.3℃，一般维持20min，即可杀死一切微生物的营养体及其孢子。

高压蒸汽灭菌是依据水的沸点随水蒸汽压的增加而上升，加压时为了提高水蒸汽的温度。蒸汽压力与蒸汽温度关系及常用灭菌时间见表1-1。

表1-1 高压蒸汽灭菌时常用的灭菌压力、温度与时间

蒸汽压力 MPa 0.056 0.070 0.103 kgf/cm 0.56 0.70 1.00 2lbf/in 8.00 10.00 15.00 112.6 115.2 121.0 30 20 20 2蒸汽灭菌温度/℃ 灭菌时间/min *Pa，帕斯卡（压力单位，1Pa=1N/m2）；与过去惯用单位间的换算关系为：

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1 kgf/cm=9.80665×10Pa，1 lbf/in=6.89475×10Pa。

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高压蒸汽灭菌技术关键是在压力上升之前需将锅内空气排尽。若锅内未排除的冷空气滞留在锅内，压力表虽指0.1MPa，但国内温度实际只有100℃（空气排除成都与温度关系见表1-2），结果造成灭菌不彻底。

表1-2 空气排除程度与温度关系

压力表读数 MPa 0.034 0.069 0.103 0.138 0.172 0.206 灭菌器内温度/℃ 未排除空气 排除1/3空气 排除1/2空气 排除2/3空气 完全排除空气 72 90 94 100 109 90 100 105 109 115 100 109 112 115 121 109 115 118 121 126 115 121 124 126 130 121 126 128 130 135 待灭菌物品中的微生物种类、数量与灭菌效果直接相关。一般在校史馆、锥形瓶中小容量的培养基，用0.1MPa灭菌20min，大容量的固体培养基传热量慢，灭菌时间适当延长（灭菌时间是指达到所要求的温度开始计算）。天然培养基含菌和芽孢较多，较合成培养基灭菌时间略长。

灭菌时的过高温度常对培养基造成不良影响，如：

（1）出现混浊、沉淀（天然培养基成分加热沉淀出大分子多肽聚合物；培养基中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、Sb等阳离子与培养基中的可溶性磷酸盐共热沉淀）。

（2）营养成分破坏或改变（酸度较高时淀粉、蔗糖、乳糖或琼脂灭菌过程易水解；pH7.5、0.1MPa灭菌20min，葡萄糖破坏20%，麦芽糖破坏50%，若培养基中有磷酸盐共存，葡萄糖转变成酮糖类物质，培养液由淡黄变为红褐色，破坏更为严重）。

（3）pH7.2时培养基中的葡萄糖、蛋白胨、磷酸盐在0.1MPa灭菌15min以上可产生对微生物生长的某种抑制物。

（4）高压蒸汽灭菌后培养基pH下降0.2~0.3。

（5）高压蒸汽灭菌过程会增加冷凝水，降低培养基成分浓度。对于前三种

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