愈创木酚法测定过氧化物酶活性

一、实验目的

过氧化物酶它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。

二、实验原理

在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收值，故可通过测470nm 下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。

三、实验材料 马铃薯块茎。 四、设备与试剂

分光光度计，离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。

0.05 mol·L的磷酸缓冲液（pH 5.5）；0.05 mol·L愈创木酚溶液；2％H2O2；20％三氯乙酸

五、实验步骤 （一）酶液的制备

取1.0～5.0 g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000×g离心10 min，上清液转入25 mL容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。

（二）过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反应体系：

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依次加入2.9 mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液；1.0 mL2％H2O2；1.0 mL 0.05 mol·L-1愈创木酚和0.1 mL酶液。用加热煮沸5 min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34℃水浴中保温3 min，然后迅速稀释1倍，470 nm波长下比色，每隔1 min记录1次吸光度A470，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位（U）。

六、实验结果

以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。 △A470×VT

过氧化物酶活性(U·g-1·min-1)=────── W×VS×0.01×t 式中：

△A470——反应时间内吸光度的变化； W——马铃薯鲜重（g）； t——反应时间（min）； VT——提取酶液总体积（mL）； VS——测定时取用酶液体积（mL）。 七、注意事项

酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。

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