原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰

PEG分子末端有两个可被活化的羟基，但化学修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（MPEG），只带一个可被活化的羟基。

3、半衰期：酶活力降低原来活力一半所经过的时间。 酶的稳定性用酶的半衰期表示。 4、大分子修饰后酶性质的变化 （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性

半衰期：酶活力降低原来活力一半所经过的时间。 （3）降低抗原抗体反应

5、L—天冬酰胺酶的作用机理（或换一种酶）

如，L—天冬酰胺酶经聚乙二醇结合修饰后，抗原性完全消除（修饰方法同上）。L—天冬酰胺酶具有较强的抗肿瘤作用。当天冬酰胺酶（分解天冬酰胺）注射进入人体后,人体的正常细胞内由于有天冬酰胺合成酶,可以合成L-天冬酰胺而使蛋白质的合成不受影响.而对于缺乏天冬酰胺合成酶的癌细胞来说,由于本身不能合成天冬酰胺,外来的天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解掉,(它能将肿瘤细胞生长所需的L—天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨.)因此蛋白质合成合成受阻,从而导致癌细胞死亡. 从而特异地、有效地抑制肿瘤细胞的生长。在国内外，是治疗淋巴性白血病、恶性淋巴肿瘤，治疗指数最高的药物。但由于它来源于微生物，对人而言是一种外源蛋白质，有较强的免疫原性。研究表明，用聚乙二醇修饰能较好地克服这一缺陷。1994年，美国FDA正式批准该药在美国上市。商品名为Oncaspar。 6、为什么用PEG修饰后的疫苗，某些人注射仍会产生抗原性？ 8、酶分子的侧链基团修饰

1、采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。

2、酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。 精氨酸残基的侧链是胍基 半胱氨酸残基的侧链是巯基 酪氨酸残基的侧链是酚基 组氨酸残基的侧链是咪唑基 色氨酸残基的侧链是吲哚基 9、肽链有限水解修饰

利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 例：酶原的激活 10、氨基酸置换修饰

现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术

第六章 酶、细胞、原生质体固定化 1、直接应用酶的不足之处:

(1)酶的稳定性差,在温度、pH和无机离子等外界因素的影响下,容易变性失活 (2)酶的一次性使用：酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产

(3)催化产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难 怎样才能获得理想的生物催化剂?答案：固定化酶、固定化细胞

2、固定化酶的定义

固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的酶。反应后的酶可以回收重复使用。

3、酶固定化：将酶固定在载体上，制备固定化酶的技术过程称为酶固定化。 4、固定化酶的优点

酶的使用效率提高,成本降低。

在大多数情况下,能够提高酶的稳定性; 较游离酶更适合于多酶反应;

可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应 极易将固定化酶与底物、产物分开; 可以增加产物的收率,提高产物的质量; 产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺;

酶反应过程能够加以严格控制; 5、固定化酶存在的缺点

① 固定化时,酶活力有损失;

②增加了生产的成本,工厂初始投资大;

③只能用于可溶性底物,而且适于催化小分子底物,对大分子底物不适宜; ④与完整菌体相比不适宜于多酶反应,特别是需要辅助因子的反应; 6、酶固定化方法 1、吸附法 2、包埋法 3、结合法 4、交联法 5、热处理法

7、吸附法：用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法。 (1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.

8、包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法 (1) 凝胶包埋法 (2)半透膜包埋法

(1) 凝胶包埋法（最广泛的固定化方法）

天然凝胶：条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差

合成凝胶：强度高，耐温度、pH值变化强，因需聚合反应而使部分酶变性失活 适用性：不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化 为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄露出来，凝胶的孔径应控制在小于酶分子直径的范围内，这样对于大分子底物的进入和大分子产物的扩散出去都是不利的，所以凝胶包埋法不适用于那些底物或产物分子很大的酶类的固定化。 常用的包埋剂如：聚丙烯酰胺凝胶。

先把酶与丙烯酰胺单体分散于疏水介质,再进行聚合。

(2)半透膜包埋法

半透膜：聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小，固定化的酶不会从小球中漏出来

适用性：底物和产物都是小分子物质的酶（需能穿过半透膜的孔径） 微胶囊：半透膜包埋法制成的固定化酶小球叫微胶囊。直径一般只有几微米至几百微米。 9、结合法：选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法 (1)离子键结合法

载体:DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等不溶于水的离子交换剂 操作:将酶液与载体混合搅拌几个小时;

或将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱;

活力损失少,结合力较弱，条件(pH值和离子强度)改变时,酶易脱落

(2)共价键结合法

是载体结合法中报道最多的方法;

载体分类:纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等;

方法：载体活化（活化后载体与酶才能形成共价键）:借助某种方法，在载体上引进某一能够与酶分子上某一基团反应的活泼基团

优点:结合很牢固，酶可连续使用较长时间

缺点:操作复杂，共价结合可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性 载体活化方法：1、重氮法; 2、叠氮法; 3、溴化氰法; 4、烷基化法。 10、交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的技术称为交联固定化技术。

特点：此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是不使用载体

双功能试剂：戊二醛、己二胺、双偶氮苯等 交联时pH值一般与酶分子的等电点相同。 优点：结合牢固，可以长时间使用

缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小，使用不便 双重固定化将交联法与吸附法、包埋法联合使用

11、热处理法：在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体的技术称为热处理固定化技术。

适用性：热稳定性较好的酶的固定化

严格控制好加热温度和时间

12、固定化酶的性质（四个方面）：1、稳定性 2、最适温度 3、最适pH 4、底物特异性

稳定性：比游离酶的好

（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。 （2）保存稳定性好，保存时间延长。

（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。

（4）对变性剂(如尿素、有机溶剂、盐酸胍等)的耐受性提高，仍保留较高的酶活力。

最适温度：与游离酶差不多

用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能不同

最适pH值

酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶—pH曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响

影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个：

(1)载体的带电性质对最适pH的影响 (2)产物酸碱性对最适pH值的影响 带负电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的高 带正电荷的载体，固定化酶最适pH值比游离酶的低 不带电荷的载体，固定化酶最适pH值一般不变 (2)产物酸碱性对最适pH值的影响

酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高 碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低 中性:固定化酶的最适pH值一般不变 原因:载体障碍产物的扩散