目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以恢复细胞的生命活动能力。

方法：在试管斜面上培养1-3代。 2 ）扩大培养

目的：活化后的菌种经过一级至数级的扩大培养，以获得足够数量的优质细胞。 培养基称为种子培养基。

方法：分为实验室培养和车间培养两个阶段 扩大培养应注意的事项：

（1）尽量减少传代次数，以降低菌种衰退和污染的可能性； （2）培养基成分一般应比发酵培养基的氮源丰富；（丰富氮源，碳源少些）

（3）培养时间一般控制在微生物生长的对数生长期，及时接入下一级培养或发酵罐； （4）严格控制培养条件（pH、温度、通气量等），加强培养过程的实时监测。 15、pH值的调节控制（详解见书P45） 1）影响pH值的因素

一般来说，培养基成分中C/N比高，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N比低，发酵液倾向于碱性，pH高。

不同盐的利用对pH也会产生影响。 pH值还与通气量有关。 16、生产中控制pH值的方法

①调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比； ②添加缓冲液维持一定的pH值（如磷酸盐）；

③发酵液中pH过高，加糖或淀粉来调节。反之，加尿素或液氨； ④通过调节通气量来实现 5加酸、碱。 ○

17、如何提高酶的产量（有吗，有则后期再看）

第三章 动、植物细胞培养产酶（第二次重点中未勾）

1、动、植物细胞培养的概念：动、植物细胞培养是通过特定技术获得优良的动、植物细胞，然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养，以获得所需产物的过程。 2、植物、微生物、动物细胞的特性比较

植物细胞>动物细胞>微生物细胞。

动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。 植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。

植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。

植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。

2、植物细胞培养的特点（与从植物中提取分离这些物质相比）（了解） 提高产率 缩短周期

易于管理，减轻劳动强度 提高产品质量 其他

3、外植体概念

指从植株取出，经过预处理后，用于植物组织和细胞培养的植物组织（根、茎、叶、芽等）片段或小块。

外植体的分离方法：选择生长力旺盛、无病害虫、生长有规律的植珠-----切成0.5-1cm左右的小块----70%-75%乙醇----5%次氯酸钠-----10%漂白粉-----0.1%升汞（消毒）----无菌水充分漂洗。

4、愈伤组织：能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团。

愈伤组织如何获得：将外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团

5、原生质体：是除去细胞壁后得到的微球体 如何防止原生质体细胞壁再生： 6、植物细胞培养产酶的工艺过程 P72

以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例（不一定是这个没，但过程要清楚) (1)大蒜愈伤组织的诱导

选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。

在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。

(2)大蒜悬浮细胞培养

将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。

然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。

(3)酶的分离纯化(提取分离纯化的应细化，如选用何种方法，如何做，怎么鉴定）

细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。 7、原代细胞：指从体内分离的细胞直接进行培养的培养物，该细胞最接近体内细胞，结果和结论最可靠。但原代细胞的纯度不高，实验重复性不好，操作难度大。 8、细胞系：原代细胞一经传代便成为细胞系。如果细胞获得了“不死性”，便称为无限细胞系，否则称为有限细胞系。原代细胞传代次数的增多将导致细胞性状的广泛变异，细胞系已远离了机体原来的细胞性状。由于优势细胞的快速增殖，细胞系纯度趋向于单一。

9、细胞株：经过单克隆化的细胞群体。为纯度相对最高的无限细胞系。细胞株只能视为具有或保留了某种特性的、有生命活性的实验材料

10、细胞生长：包括了细胞迁移、形变、体积增大、数目增多。其中数目增多的过程称为细胞增殖。

11、细胞代数：指细胞传代次数而不指细胞增殖次数。

12、动物细胞培养的方式：悬浮培养、贴壁培养、固定化细胞培养

第四章 酶的提取与分离纯化

1、下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。 2、酶分离纯化包括三个基本环节

抽提、纯化、制剂

3、细胞破碎——只对胞内酶 细胞破碎的方法：

1）机械破碎法 2）物理破碎法

3）化学破碎法 4）生物法（酶解）

4、酶的抽提：指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的抽提。 一）抽提方法

四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂，水。（四稀原理）

稀盐原理：大多苏蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，称为盐溶现象。当盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。所以一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02-0.5mol/L。

稀酸原理：有些酶在酸性条件下溶解度大，且稳定好，宜用酸溶液提取。提取时要注意酸溶液的pH不能太低，以免酶变形失活。

稀碱原理：有些酶在酸性条件下溶解度大，且稳定好，宜用碱溶液提取。提取时要注意酸溶液的pH不能太高，以免酶变形失活。同时加碱液时要一边搅拌一边缓慢加进，以免出现局部uojian，引起酶的变性失活。

稀有机溶剂的原理：与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶，可以采用能与水混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。在核酸类酶的提取中，可以采用苯酚水溶液。 二）抽提过程中的注意事项

1、pH值：选择的pH值不超出酶的酸碱稳定范围； 最好远离待抽提酶的等电点。

2、温度：通常控制在0~10℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。 3、抽提液体积（用量）

抽提液的用量一般为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次反复抽提。 4、为提高酶的稳定性，可以加入适量的保护剂。 5、酶的沉淀分离（方法+原理）（5种）

一、盐析沉淀法 (salting out)

1、原理：不同蛋白质在不同盐浓度条件下溶解度不同；通过添加中性盐，改变盐浓度分离蛋白。（盐析盐溶）

盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中被离解为正离子和负离子，由于反离子作用，使蛋白质表面的电荷改，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分

子表面的电荷改变。

2、硫酸铵盐析的优点（硫酸铵最为常用）

优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉易得；

③可保护酶，不影响酶的活性。

缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。遇碱会放出NH4+，干扰蛋白质测定；对离心机等有腐蚀作用；酶制剂若用于食品，会影响口感。

3、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素

（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实验确定。

（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。 （3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作

（4）蛋白质浓度：样品液的蛋白质浓度一般控制在2.5~3.0% 为宜，太浓时应适当稀释，以减少杂蛋白共沉淀。

（5）脱盐：超滤、透析或层析。

二）等电点沉淀 (isoelectric precipitation)

1、原理：利用两性电解质等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶和杂质分离。

溶液的pH等于溶液中某两性电解质等电点时，该两性电解质的静电荷为零，分子间的静电斥力消失，使分子能聚集在一起而沉淀下来。

2、实际操作

与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。（原因：由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子物质仍有一定的溶解性，从而使沉淀不完全）

单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较大的杂蛋白 。 3、注意

加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高 (三) 有机溶剂沉淀

1、原理：利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂使酶或杂质沉淀析出，从而使酶和杂质分离。

有机溶剂之所以能使酶沉淀析出，主要是由于在待分离的酶液中加入与水互溶的有机溶剂使溶液介电常数降低，酶蛋白分子间引力增大而相互产生聚集，从而降低溶解度而析出沉淀。对于有水化膜的酶分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水化膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。

2、实际操作中常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇和甲醇等。 （四）复合物沉淀法

1、原理：酶与加入的其他物质形成复合物，进而沉淀 （五）选择性变性沉淀法

1、原理：选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶。

6、酶分离纯化中几种常见的膜分离技术 一） 微 滤(MF)：细胞不能通过

二） 超 滤(UF)：细胞、大分子不能通过 四） 反渗透(RO)：只有水能过。