保护酶活性测定方法

一、过氧化物酶（POD）活性测定

1、 酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布

过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。 2、 试剂：

0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液

0.05 mol/L 愈创木酚溶液（2-甲基酚）

20%三氯乙酸溶液 2%H2O2

3、 仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管 4、 过氧化物酶活性测定： （1）加入反应混合液 2.9 ml磷酸缓冲液

1 ml愈创木酚溶液（2-甲基酚）

1 ml H2O2 0.1ml酶液

（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并加入2ml三氯乙酸溶液终止反应 （3）过滤，适当稀释。在470nm处测OD470。 5、 结果计算：

以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。即 酶活力=OD×D / 0.01t

酶的比活力= OD×D /（0.01tw） 其中：OD为反应时间内吸光度的变化

W为材料鲜重 t为反应时间

D为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数

二、多酚氧化酶（PPO）活性测定

1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布

1

过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。 2、试剂：

0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液 0.05mol/L儿茶酚溶液（邻苯二酚） 20%三氯乙酸溶液 2%H2O2

3、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管 4、多酚氧化酶活性测定： （1）加入反应混合液

3.9 ml磷酸缓冲液 1 ml 儿茶酚溶液 0.1 ml酶液

（2）37℃水浴锅中保温15min,迅速转入冰浴，并立即加入2ml三氯乙酸溶液终止反应。 （3）过滤，适当稀释。在525 nm处测OD525。 （4）结果计算：

以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。即 酶活力=OD×D / 0.01t

酶的比活力= OD×D /（0.01tw） 其中：OD为反应时间内吸光度的变化

W为材料鲜重 t为反应时间

D为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数

三、超氧物歧化酶（SOD）活性测定

1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至10ml，低温离心（12×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。 2、试剂：

14.5 m mol/L 甲硫氨酸溶液（A） 3×10-3 m mol/L 乙二胺四乙酸（B） 2.25 m mol/L 氯化硝基四氮唑蓝（C）

2

60×10-3 mol/L 核黄素（D） 0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液

3、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管 4、超氧物歧化酶活性测定： （1）加入反应混合液

甲硫氨酸溶液（A） 3 ml 乙二胺四乙酸（B） 2 ml 氯化硝基四氮唑蓝（C） 2 ml 核黄素（D） 2 ml

（2）在盛有反应混合液3 ml 的试管中，加入0.1 ml酶液，混合后放在透明的试管架上，

在25℃生化培养箱中，光照15min，并立即遮上黑布终止反应。 （3）过滤，适当稀释。在560 nm处测OD560。 （4）结果计算：

以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。即 酶活力=OD×D / 0.01t

酶的比活力= OD×D /（0.01tw） 其中：OD为反应时间内吸光度的变化

W为材料鲜重 t为反应时间

D为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数

四、苯丙氨酸解胺酶（PAL）活性测定

1、酶液的制备：称取样品3 g，加入预冷的0.05 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液少量，用粗纱布过滤，定容至50ml，低温离心（10×104r/min,0~4℃）15min,取上清夜置于低温冰箱备用。 2、试剂：

0.05 mol/L Tris-H2SO4缓冲液（pH8.8）：称取Tris 6.057 g溶于水中，用H2SO4调节pH值至8.8，用水定容至1L。

0.02 mol/L 苯丙氨酸溶液：称取3.3038 g苯丙氨酸，溶于1L的0.05 mol/L Tris-H2SO4缓冲液（pH8.8）。

PAL酶提取液：称取Tris 12.114g, EDTA-Na 0.3722 g,甘油76.2 g，巯基乙醇0.52 ml，溶于

3

水中，用H2SO4调节pH值至8.3，用水定容至1L。

3、仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸量管 4、苯丙氨酸解氨酶活性测定： （1） 加入反应混合液 试剂 处理 对照 空白（调零用） 苯丙氨酸溶液 2 2 Tris-H2SO4缓冲液（pH8.8） PAL酶液 备注 4 6 6 2 2 只需1管 （2）30℃水浴锅中保温30min。 （3）在290 nm处测OD290。 （4）结果计算：

以每分钟内OD变化0.01为1个酶活力单位。即 酶活力=OD×D / 0.01t

酶的比活力= OD×D /（0.01tw） 其中：OD为反应时间内吸光度的变化

W为材料鲜重 t为反应时间

D为稀释倍数。即提取的总酶液为反应系统内酶的倍数

测定方法苯丙氨酸解氨酶活性测定按欧阳光察方法[5]; 多酚氧化酶活性测定按朱广廉方法[6]稍加修改; 过氧化物酶活性测定采用比色法[7];

可溶性蛋白质含量测定以牛血清蛋白为标准蛋白,按Folin-酚法测定[8]。

参考文献：

[2]周爱琴,祝军,生吉萍,等.苹果花青素形成与PAL活性及蛋白质含量的关系[J].中国农业大学学报,1997,2(3):97-99.

[3]吴振先,苏美霞,陈维信,等.贮藏荔枝果皮多酚氧化酶及过氧化物酶与褐变的研究[J].华南农

4

业大学学报,1998,19(1):12-15.

[4]张华云,王善广,牟其芸,等.套袋对莱阳茌梨果皮结构和PPO、POD活性的影响[J].园艺学报,1996,23(1):23-26.

[5]上海植物生理学会.植物生理学实验手册[M].上海:上海科技出版社,1985.191-192. [6]朱广廉,钟海文,张爱琴.植物生理学实验[M].北京:北京大学出版社,1990.37-40. [7]张志良.植物生理学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1990.154-155.

[8]LowryOH,RosebroughNJ,FarrAI.ProteinmeasurementwithFolinphenolreagent[J].BiolChem,1951,193:265-275

[12]欧阳光察,薛应龙.植物苯丙烷类代谢的生理意义及其调控[J].植物生理学通讯,1988(3):9. [15]韩涛,李丽萍.果实和蔬菜中多酚氧化酶的作用[J].北京农学院学报.1998,13(2):115-124. [16]万善霞,秦岭,于同泉,等.水分胁迫对板栗幼苗过氧化物酶、超氧物岐化酶活力及同工酶谱的影响[J].北京农学院学报.1997,12(3):20-25.

5