一、RNA的反转录

① 在小EP管中依次加入

RNA模板 5 μl Olig（dT）18引物 1μL DEPC H2O 6 μL 混合后，70℃水浴5 min（破坏二级结构），迅速冰浴5min。 ② 在管中依次加入 (反应体系为20 μL)：

RT 5×buffer 4μL RNasin 1μL 10mM dNTP 2μL 混匀，37℃ 5min。 M-MULV反转录酶 1 μL 置于 42℃水浴，1h。 ③ 70℃保温5min（使酶失活）。 ④ 于-20℃保存备用。 一、PCR扩增DNA

在灭菌的0.5ml PCR管中，依次加入 20μl cDNA

10μl 10×PCR buffer 5μl dNTP 2μl RT引物I 2μl RT引物II

1μl Taq DNA聚合酶 加ddH2O 补足50μl ，混匀。 PCR程序：

94 ℃ 3 min

95 ℃ 30 s 35 cycles: 55 ℃ 60 s 72 ℃ 90 s

72 ℃ 10 min 三、PCR产物的鉴定

取20ul PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。

四．结果与分析

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如上图所示，中间最亮的条带即为扩增产物，上面的暗条带则为被污染的植物基因组，主要由于提取不彻底，使一些DNA与RNA混合在一起,，亮条带下方则为小RNA杂质，提取过程中因受RNA酶的干扰，导致部分提取的RNA被切成小片段.

southern杂交

一、目的

学习Southern杂交的原理及操作方法。

二、原理

1975年Southern发明了Southern blot分子杂交方法。这项技术包括在琼脂糖凝胶上按片段大小电泳分离待检的DNA；用NaOH对凝胶中的DNA进行变性处理；通过毛细管作用将单链DNA吸附到硝酸纤维素膜上；然后用标记好的探针进行杂交，洗掉没有杂交的游离探针；经放射性自显影（放射性标记探针）或生化检测（非放射性标记）就可以证明基因片段与已知探针是否具有同源性，达到检测样品基因的目的。因此，Southern印迹杂交包括两个步骤①把电泳分级的DNA转移到固定支持膜上。②与标记的DNA探针杂交。

地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。

所用的杂交膜可以选择硝酸纤维素和尼龙膜。硝酸纤维素膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测，且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电的膜和不带电的膜两种。带正电的膜对核酸结合力强，敏感性也高。不带电的结合力低。敏感性差。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，用洗脱液（0.1×SSC,0.1%SDS）煮沸5-10分钟后去探针，可用于新的探针杂交。如果对杂交结果不满意，如背景太高或显色不强，也可洗去探针之后重新杂交。

三、步骤

（一）探针的标记

1、用灭菌去离子蒸馏水稀释1μgDNA至总体积16μl.。

2、DNA热变性：把DNA置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。

3、加4μl DIG Random Labeling Mix(高效)，混匀后再离心2000/rmp 5分钟。 4、置于37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记DNA的产量。应根据需要控制反应时间。

5、加入2μl EDTA以终止反应，对于原位杂交和膜反应杂交来说，标记反应可告结束，上述反应液置于-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。

可根据下表估计标记产量：单位（ng） DNA模板量 标记一小时 10 30 100 300

标记二十小时 600 1050 1500 2000 14

45 130 270 450 1000 3000 850 1350 2300 2650 （二）Soutern转移

1、将目的基因经琼脂糖凝胶电泳的胶板从电泳槽中取出，凝胶浸入0.25M HCl 中10分钟。HCl处理的作用主要是通过嘌呤使DNA分子断裂，因而有利于高分子量DNA的转移，但不能处理时间过长。要转移全部小于10kb的DNA片段时可省略此步骤。

2、进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20-30分钟。 3、把凝胶浸入变性液中，室温浸泡15分钟×2次。 4、蒸馏水漂洗凝胶2次。

5、把凝胶浸入中和液中，室温泡15分钟×2次。 6、处理凝胶的同时，切一张同样大小的尼龙膜或者硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜用2 × SSC 浸泡。剪两张Whatman3#滤纸和吸水用的粗滤纸。注意不要用手直接触及膜面。

7、准备转移用平器和支架，平器中放20 × SSC 。支架上搭滤纸桥使得溶液能够虹吸上来。

8、依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，吸水纸，玻璃板，适量重物（500-1000g）。注意：检查pH值，用硝酸膜时pH<9。要确保各层间没有气泡，否则会发生局部绝缘，气泡处的DNA 难以吸附到膜上。

9、于室温转移12-20小时。

10、取出转移膜，用2 x SSC 漂洗数次，以去处困难吸附在膜上的凝胶。 11、固定：可选择下述方法之一进行DNA固定。

·紫外线固定：使用长波紫外线照射10-20分钟，简单漂洗干燥备用。 ·尼龙膜置于+120℃烘烤30分钟。

·硝酸纤维素膜置于普通烘箱中80℃烘烤2小时

（三）Southern杂交

1、将转移好的尼龙膜或硝酸纤维素膜装入杂交管中，贴壁放置（吸附有核酸的一面不要贴壁），赶走杂交膜和管壁间的气泡。

1、 加入20ml Standard buffer，65℃预杂交4-20小时。

3、将制备的DNA探针沸水浴加热10min。然后迅速插入冰中。全部加入杂交管。 4、使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16—20小时。

5、杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中，储存于—20以备下次使用。这样至少可以保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃ 10分钟以变性探针。

6、取出杂交膜，用Wash Solution I 洗5分钟X 3次。

7、保温冲洗：用 Wash Solution II 于68℃冲洗15分钟X 2次。 （四）BCIP/NBT 显色检测法

1、经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。 2、用干净的平皿，封闭液室温封闭至少60分钟。

3、用封闭液1：2500—5000稀释 Anti-DIG-AP，例如2ul Anti-DIG-AP加至5—10ml封闭液中（根据染色情况而调整）。稀释液4℃可稳定12小时左右。

4、加Anti-DIG-AP，37℃反应60分钟。

5、用冲洗液洗15分钟X 3次，每次100ml。

6、按1：50配制底物显色液：例如100ul“BCIP/NTP储备液”加至5ml显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。

7、显色缓冲液20ml平衡2分钟后倾掉。 8、加100ml底物显色液（100 cm2）。将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。显

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色过程中可以观察。一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续至12小时。应绝对避免震动，以免出现颜色带的移位。

9、当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液，在此情况下，颜色长期不退。还有一种选择时让膜干燥，颜色消褪。但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。

四．结果与分析

左图为电泳转过膜后的电泳胶带照片，由图可知，质粒和PCR以及酶切的产物基本上都已转到了膜上；

右为膜的照片，左起依次为酶切，PCR和酶切结果,分析可知，图中酶切结果较好，出现明显条带，其中后三条最为突出。

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