上图为菌落的PCR电泳结果，中起靠右的第一条带为MArKER，其余为菌落的ＰＣＲ结果，分析上图可知，个别组未产生条带，主要由于菌落挑取不足或失败，从而导致缺少ＤＮＡ，故PCR扩增后无产物。

上图为ＧＦＰ绿色荧光蛋白图，绿色荧光蛋白（GFP）基因来自海底生物多孔水母，该基因表达产物在紫外光照射下可发出绿色荧光。现已将该基因克隆到阿拉伯糖启动子驱动的原核表达pGLO中，通过阿拉伯糖的诱导，可使该基因在细菌中进行表达。

植物基因组DNA提取，酶切及电泳

一、目的

掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。

二、原理

十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中，首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片，下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。

由于CTAB能溶解于乙醇，在洗涤过程中CTAB即可被除去。

三．步骤

（一）基因组DNA提取

1、取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700μl抽提液（65℃预热）混匀，放入65℃水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。

2、取出裂解好的DNA ，加入700μl 氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（10000rpm,10分钟）。

3、取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放置半小时以上。

4、将析出的DNA 离心，14000rpm,10分钟。

5、去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，离心干燥，溶于50μl TE或水中。 （二）酶切及电泳分析

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1、按照下表加入各成分。 管号 λ基因组DNA/μg 植物基因组DNA EcoRⅠ/ ul EcoRⅠBuffer（10×） Hind III / ul Hind III Buffer（10×） ddH2O/ ul RNA酶 ① 1 1 2 26 ② 1 1 2 26 ③ 10 2 5 13 ④ 10 2 5 13 ⑤ 10 2 5 2 5 6 ⑥ 10 2 5 2 5 5 1 37℃反应4h，迅速加入2 ul EDTA 中止反应。0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）

1、 10000rpm离心20 S混匀，37℃反应4h。 2、 0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。 3、 观察并记录结果。 四．结果分析

植物基因组ＤＮＡ酶切结果

PCR结果

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由植物基因组ＤＮＡ酶切结果可以看出，左起第三条带酶切结果显著，图中部分条带见出现了空区域，可能是点样过程中遗漏所致.

在PCR图中，第一排中起第一条带为Marker,倒数第三条带最亮，酶切最为成功; 第二排中每条带中央亮条带为扩增产物，而下方较暗的条带则为RNA.

植物RNA提取，电泳及PT—PCR扩增

一、目的

1.掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。 2.学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

二、原理

1. RNA提取

RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。

RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量一般比较小，而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的溶解性。 RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。 判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性（是否被降解）。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带（如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带）。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。

2. RT—PCR

普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子，所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除，是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（d T）的引导下合成mRNA互补的DNA（complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含

，，

内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5和3端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。

三．步骤

RNA提取

1、取植物叶片1-3克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分装，小

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量提取试剂量可减至1／10)

2、液氮挥发完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的离心管中，迅速反复倒置混匀，直至看不见任何团状物为止。

3、立即加入10毫升的等体积（酸性）酚/氯仿，剧烈（！）反复倒置混匀5至10min（如在震荡器上震荡，要确保混匀而不能仅仅是振动！）。

4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。 5、重复步骤3和4，三次左右（注意观察界面上白色物质）。 6、取上清，加入等体积的氯仿，反复倒置混匀2-5min。 7、13000g×5min。 8、取上清，加入1/3体积8 M 的 LiCl （即8 M LiCl应占最后体积的25%）， 沉淀RNA，4℃过夜。

9、离心13000g × 10 min。

10、弃上清,保留沉淀（此时应把RNA沉淀转入Eppendorf管中，以便于操作）, 加入70%无水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗涤沉淀数分钟（和缓地反复倒置混匀），离心 （13000g × 2 min）。重复洗涤沉淀数次。

11、用70%乙醇再洗涤2次沉淀，去掉盐离子。 12、用枪头吸去残留的液体，真空干燥2min。 13、加入200 ul DEPC 处理过的水溶解RNA。

14、取用5 ul电泳检测RNA完整性, 用TEB 缓冲液, 200V× 20-30min。 15、取5 ul稀释40倍测定RNA纯度和浓度，A260 /A280 应在 2.0 左右。 16、将RNA 分装,放在-70℃长期保存备用. 辅助方案：试剂盒提取法（Trizol） （一）试剂：

1.Ttizol Reagent

2.氯仿 3.异丙醇

4.70%无水乙醇 5.DEPC （二）器材：

1、 研钵 2、 离心机 （三）实验步骤

1、 称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离

心管中。

2、 加入1 ml Trizol Reagent，15～30℃×5min。 3、 加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。 4、 冷冻离心12 000 rpm×15min。

5、 将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀 ，-20℃放置

20min。

6、 冷冻离心12 000 rpm×10min。

7、 加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀，悬浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。 8、 加入30 ul DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。

PT—PCR扩增

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