10×dNTP Primer P1 Primer P2 模板 Taq 酶 5μl 1μl 1μl 1μl 0.5μl 2、设置PCR程序：

94 ℃ 180s 94 ℃ 45s 30 cycles: 55℃ 45s

72 ℃ 60s 72 ℃ 600s 3、运行PCR程序 （二）PCR产物鉴定

反应结束后，取20μl PCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。

3 .酶切：

（一）质粒DNA酶切

1、 按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf管中，要注意管号。

管号 质粒DNA EcoRⅠ/ μl 酶切Buffer（10×）/ μl ddH2O/ μl RNA酶 ① 10 2 8 ② 10 1 2 7 ③ 10 1 2 6 1 2、 加样后混匀，置于37℃水浴中，保温2小时。然后每个管中加入4 μl

Loading buffer。 （二）琼脂糖凝胶电泳 1、琼脂糖凝胶的制备

称取0.4g琼脂糖加入40ml 0.5×TBE缓冲液中，加热熔解。冷却至65℃时加入2 μl EB，混匀。 2、胶板制备

将凝胶槽洗净擦干，两端用胶布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，去掉两端封条，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入0.5× TBE缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2毫米。 3、 加样

每个样品中加入1/10体积点样缓冲液，混匀后小心地加入样品槽中，要避免相互污染。

4、 电泳观察

接通电源，电压为80V，电泳1小时左右，当溴酚蓝到达下沿1--2㎝处时，停止 泳。

5、 观察及照相

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将胶板拿出，用自来水小心地冲洗一下。在紫外灯下观察结果，如果有条件也可用凝胶成像系统照相。

四．实验结果与分析

1．质粒DNA提取与电泳检测结果

上图所示，为第一次提取的质粒DNA产物，上排为GFP，下排为P38；

上排第一个，下排两个胶的第一个均为MARKER，由于在点样过程中，部分同学将P38加在第一排，故导致GFP条带的颜色很深。

由上图可以看出，只有少数P38提取较成功，主要由于提取过程中菌体用量较少。

上图为第二次提取的P38检测结果，因此次菌体的浓度比首次提取所用的大得多，所以条带颜色明显较深，且位于同一直线上。

2. PCR结果：

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由上图可知，PCR扩增效果较好。

左边的第一条带为ＭＡＲＫＥＲ，后面ＰＣＲ的产物。

由于第13个孔在点样时遗漏，故无条带产生，而其他的颜色都较亮，且ＰＣＲ产物都位居同一条线上。因为引物Ｍ１３Ｆ和Ｍ１３Ｒ中间的产物呈指数扩增，故分析可知，中间最亮条带的即为Ｍ１３Ｆ和Ｍ１３Ｒ之间的产物。

3.酶切后的电泳检测结果：

由上图知，第一条带为MARKER, 之后为P38的酶切结果。

若无RNA，图像为两条带，下为DNA，上酶蛋白，而10的那个则是没有加RNase

GFP和TA克隆的转化和观察

一．目的

掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。

二．原理

受体细胞经过一些特殊方法如电击法, 化学试剂法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

三．步骤

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·感受态细胞的制备(0.1M CaCl2方法)

1、 从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，

37℃×200rpm×12-16h，可过夜培养。

2、 将活化菌体按1`～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为0.4。 3、 取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中，4℃ 离心8 000rpm×1 min。

4、 弃上清，加500 ul 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。 5、 彻底除去残液, 加200 ul 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体。 6、 冰浴静置 30 min ，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。

7、 弃上清，加100 ul 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。

附注：

①、 整个过程注意无菌操作和保持低温。

②、 培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。

③、 如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。

④、 LB液体培养基建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查菌体是否污染。 ⑤、 D600值指细胞密度，用于判断培养物是否处于对数生长期。OD600值在0.4 - 0.5时，

此时培养物处于对数生长期，细胞数在20min内加倍。

。质粒对大肠杆菌的转化

1、将连接产物加入100 ul制备好的感受态细胞，冰上放置30 min。 2、42℃热激90S。 3、迅速冰浴3min。

4、加入300 ul LB液体培养基，37℃轻摇培养45min。 5、加入30 ul X-gal和6 ul IPTG,混匀。

6、取100 ul涂布在含有50 ug/ml氨苄的LB固体培养基中。 7、37℃倒置，避光培养16-20 h。

8、蓝白斑筛选，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。

四．结果与分析

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