对于愈伤组织有丝分裂指数的测定一般采用富尔根染色法。对于悬浮培养的细胞则先离心，然后置于载玻片上用乙酸洋红染色并镜检。 第六章

1，目前用做原生质体分离的材料主要有哪些？它们各自有什么有优点？

答：原生质体的来源：(1) 来自各种植物的幼嫩的叶片、根尖，其中叶片由于取材容易而广泛采用。

（2）来自花粉，尤其是适合制备单倍体的原生质体。 （3）从组织培养产生的愈伤组织中获得

2、试述原生质体分离的方法和步骤

答：(1)机械法：在细胞质壁分离的状态下，用利刀切割细胞壁,使原生质体流出或释放出来 (2)酶解法：常用的制备原生质体的酶包括；果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等。实际应用中需要根据不同的细胞来源选择合适的酶。 酶解法分：

顺序法（两步法）：先用果胶酶预处理，再用纤维素酶 直接法（一步法）：直接用果胶酶和纤维素酶 优点：获得量大，适用广泛。

缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。

3、影响原生质体分离效果的因素有哪些？试做分析 答：供试材料的基因型和外植体

酶解条件：酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度、渗透压稳定剂 质膜稳定剂

分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间、分离用具

4、原生质体纯化主要有哪些方法？ 答：1、过滤-离心法

2、漂浮法：原生质体比重较小,能在具有一定渗透压的溶液(如25%的蔗糖溶液)中漂浮，然后用吸管收集。转入另一管中，如此反复离心、悬浮2~3次，即可获得纯原生质体。优点:制备的原生质体较纯净.。缺点:丢失的较多

3、界面法：又称不连续梯度法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。

优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时保持着相同的渗透强度使原生质体免受渗透冲击而受损。

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5、为什么原生质体要培养在等渗培养基中？

答：只有培养在等渗培养基中植物才能正常生长 如果植物的原生质体培养在非等渗培养液中植物有可能会因为浓度差而吸水或是失水从而导致植物的死亡， 所以植物的原生质体要培养在等渗培养基中。

6、原生质体培养中如何稳定培养基的PH？

答：分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。为了维持酶液的PH恒定，常用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液来配制酶液。此外，MES对保持酶解物的酸碱环境也有缓冲作用。

7、试分析影响原生质体培养的主要因素

⑴供试材料的基因型和外植体

⑵酶解条件：酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度 ⑶渗透压稳定剂 ⑷质膜稳定剂

⑸分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。 ⑹分离用具

8、原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点？ ⑴液体浅层培养法： 优点：

原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：

原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 ⑵双层培养法——液体-固体双层培养法：

? 优点：

固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。

? 缺点：

不易观察细胞的发育过程。 ⑶固体薄层培养法

? 优点：

使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。

? 缺点：

培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。

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9、为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？

（1）原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。

（2）用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 10、原生质体融合要经过哪些过程？

1选择亲株 为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。

2原生质体制备 去除细胞壁是制备原生质体的关键。一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。 3原生质体融合 早期的原生质体融合实验中，曾采用离心力作用使两种细胞的原生质体紧紧挤在一起以帮助融合，或者在冷的渗透稳定剂中使原生质体密集凝聚，但这些方法的效果不佳。

4 原生质体再生 原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构。

11、PEG融合与电融合各有何特点？电融合的原理是什么？ PEG法特点：融合频率高；诱发融合无特异性；毒性较低 电融合特点：(1)融合率高、重复性强、对原生质体伤害小。 (2)装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程。 (3)免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。

电融合的原理：①交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。②施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。 12、PEG融合法的技术关键是什么？电融合的关键技术是什么？ 13、对称融合与非对称融合的细胞杂交有何异同？ 14、体细胞杂交有哪些遗传特征？如何进行鉴定？

15.原生质体融合产物有哪些类型？ 答：自发融合、诱发融合

16.试述杂种细胞的选择方法？

答：一、互补选择法：（1）生长互补选择法 （2）营养缺陷型互补选择法 （3）抗性互补选择法 （4）细胞代谢互补选择法

二、机械选择法：（1）利用融合亲本的形态色泽上的差异筛选杂种细胞 （2）利用荧光素标记分离杂种细胞

（3）应用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞

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17.如何用分子生物学方法鉴定杂种植株？

答：（1）RAPD检测，是在DNA水平上迅速、有效的鉴定体细胞杂种的简便方法。 （2）RFLP检测，具有种的特异性和遗传稳定性，能直接发现同源染色体上核苷酸碱基 序列的差异。

18.体细胞杂交有何意义？

答：（1）实现远缘杂交，形成新的物种。

（2）创造细胞质杂种。 （3）培育作物新种质和新品种。

19、体细胞杂交技术的应用现状及存在问题是什么？ 第七章

1、花药培养中如何选择外植体？

2、花药培养和花粉培养的区别是什么？

花药培养指用植物组织培养技术将发育到一定阶段的花药剥离下来（切去花丝部分），接种在培养基上进行培养，最终形成完整植株的技术

花粉培养：又称小孢子培养，或游离小孢子培养，指在无菌条件下，将花粉从花药中分离出来使其成为分散或游离态，发育成单倍体植株的过程。

就培养材料而言，花药培养属于器官培养，花粉培养属于细胞培养。

3、花药培养过程中低温预处理的原理是什么? 低温处理的作用机理：

3、低温可改变花粉粒第一次有丝分裂纺锤体的轴向，形成两个均等细胞，使得花粉朝着胚胎方向发育；

4、低温使花粉保持较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。 4、花药培养时蔗糖和激素浓度如何选择？依据是什么？

5、 花药（或花粉）培养过程中决定再生植株倍性的因素有哪些?

6、 单倍体育种的方法有哪些？P159 单倍体育种 ①原理：染色体变异

②方法：花药离体培养获得单倍体植株，人工诱导染色体数目加倍。

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