第15课时 血红蛋白的提取和分离

[学习导航] 1.通过阅读教材P64“基础知识”，掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定的方法电泳法的原理。2.分析教材P66“实验操作”，掌握蛋白质提取和分离的过程。3.阅读教材P69“操作提示”，掌握蛋白质分离过程中需注意的问题。

[重难点击] 1.尝试提取和分离血液中的血红蛋白，体验提取生物大分子的基本过程和方法。2.了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子方法的基本原理。

一、蛋白质的分离技术

1.蛋白质的分离依据

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 2.凝胶色谱法

(1)概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 形态：微小的多孔球体??

(2)凝胶的特点?组成：大多数由多糖类化合物构成

??结构：内部有许多贯穿的通道(3)常用凝胶：葡萄糖或琼脂糖。 (4)分离原理

①相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，通过凝

胶的时间较长。

②相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，通过凝胶的时间较短。 3.缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

(3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持体外溶液的pH与体内环境中的pH基本一致。 4.电泳

(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 (2)原理

①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。

②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 (3)常用的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.凝胶色谱法

(1)结合上图，根据凝胶色谱法的分离原理，填表分析不同大小的分子洗脱后的次序。

直径大小 运动方式 运动路程 运动速度 相对分子质量大 较大 垂直向下运动 较短 较快 相对分子质量小 较小 无规则的扩散运动 较长 较慢 洗脱次序

先流出 后流出 (2)结合上图，分析为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来？

答案 相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。

(3)凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？ 答案 不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入，导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。 2.电泳

(1)从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？ 答案 各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。

(2)SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？ 答案 否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质－SDS复合物，SDS它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。

归纳总结 琼脂糖凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的两点区别 ?1?分离原理不同

①琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。

②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。 ?2?用途不同

①琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。

②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。

1.凝胶色谱法分离蛋白质时由色谱柱下端最先流出的是( ) A.相对分子质量较小的蛋白质 B.相对分子质量较大的蛋白质 C.凝胶颗粒

D.葡萄糖或琼脂糖分子 答案 B

解析 凝胶色谱法分离蛋白质的原理是依据蛋白质分子相对分子质量的大小，相对分子质量大的分子不能进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度快，先洗脱出来；相对分子质量小的分子能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度慢，后洗脱出来，因此最先流出的应

是相对分子质量较大的蛋白质，而凝胶颗粒是不能流出的。 2.有关凝胶色谱法和电泳法的说法，正确的是( ) A.它们都是分离蛋白质的重要方法 B.它们的原理相同

C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要 D.以上说法都正确 答案 A

解析 不同蛋白质的相对分子质量不同，因此凝胶色谱法可以根据相对分子质量的大小分离蛋白质；电泳法中带电分子迁移速度不仅与分子大小有关，也与分子所带的电荷有关，所以A正确；B错误；这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，所以C错误。

二、实验操作和操作提示

1.样品处理 (1)红细胞的洗涤 ①目的：去除杂蛋白。 ②方法：低速短时间离心。 ③标准：直至上清液不再呈现黄色。 (2)血红蛋白的释放

加入加入10 min

红细胞蒸馏水――→到原血液的体积40%――――――→磁力搅拌器上搅拌――→血红蛋白释放。 体积的甲苯(3)分离血红蛋白溶液

2 000 r/min离心10 min①方法：混合液―――――――――――――→分层。 ②分层结果(自上而下)： 第1层：无色透明的甲苯层。

第2层：脂溶性物质的沉淀层——白色薄层固体。 第3层：血红蛋白的水溶液——红色透明液体。 第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。

③结果处理：将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 2.透析——粗分离

(1)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。

(2)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。