三、器材

1．菌种：酿酒酵母。

2．仪器或其他用具：血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。 四、操作步骤 1．制备菌悬液

2．镜检计数室：保证计数室无污物。

3．加样：用毛细滴管吸取少许酵母菌液，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡。

4．显微镜计数：先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数（即80小格）。 5．清洗血球计数板 五、思考题

1．根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？ 2．某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。

Ⅲ、平板菌落法数法

一、目的要求

学习平板菌落计数的基本原理和方法。 二、基本原理

微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一生理及培养特征进行的。也就是说一个菌落即代表一个单细胞。故又称活菌计数，一般用于生物制品检验以及食品、水源的污染程度的检定。 三、器材

1．菌种：大肠杆菌菌悬液。

2．培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

3．仪器和其他用具：1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。 四、操作步骤

1．编号：分别标明平皿和无菌水试管的稀释度。 2．稀释、取样 3．倒平板 4．计数

每毫升菌落形成单位（cfu）＝同一稀释度三个平板上的菌落平均数×稀释倍数 计数原则：

（1）计算相同稀释度的平均菌落数 ? 有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。 ? 若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计数×2 （2）选择平均菌落数在30～300之间的平板 ? 只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数即为该样品中的微生物总数。 ? 有两个在30～300间时，按两者菌落总数比值决定：比值小于2，取平均；比值大于2，取较小的菌落总数。

（3）所有菌落数均大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数。 （4）所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数。

（5）所有菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数。 五、思考题

1．为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？ 2．要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？

3．试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。

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4．当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？

5．用倒平板法和涂布计数法，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？

实验八 微生物的生理生化反应 Ⅰ、大分子物质的水解试验

一、目的要求

1．证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统； 2．掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 二、基本原理

微生物的胞外酶（如淀粉酶、脂肪酶等）将大分子物质的分解过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。 三、器材 1．菌种

? 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，普通变形杆菌。

2． 培养基：固体油脂培养基，固体淀粉培养基，明胶培养基试管，石蕊牛奶试管，尿素琼脂试管 3． 溶液或试剂：革兰氏染色用卢戈氏碘液。

4． 仪器或其他用具：无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架。 四、操作步骤 1．淀粉水解试验

制成淀粉培养基平板后，将平板分为四个区域，划线接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌后置于37℃培养24h。观察各细菌的生长情况，并滴加少量碘液于平皿中。若菌苔周围有透明圈，说明水解反应阳性。透明圈大小可初步判定该菌水解淀粉酶的能力强弱。 2． 油脂水解试验

制成油脂培养基平板后，同样划线接种上述四菌株，置于37℃培养24h后观察各细菌的菌苔颜色，若出现红色斑点，则为脂肪水解阳性。 3． 明胶水解试验

在明胶培养基中穿刺接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌，置于20℃培养2～5d后观察液化情况。 4． 石蕊牛奶试验

接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌于石蕊牛奶培养基中，置于35℃培养24～48h后观察培养基颜色变化情况。石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性为紫色，而被还原时为白色。 5． 尿素试验

接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌于尿素培养基中，置于35℃培养24～48h后观察培养基颜色变化情况。尿素酶存在时为红色，否则为黄色。 五、思考题

1．你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ 2．不利用碘液，你怎么证明淀粉水解的存在?

3．接种后的明胶试管可以在35℃培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？ 4．解释在石蕊牛奶中的石蕊为什么能起到氧化还原指示剂的作用？ 5．为什么尿素试验可用于鉴定Proteus细菌？

Ⅱ、糖发酵试验

一、目的要求

1．了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用； 2．掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 二、基本原理

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应。有些细菌分解某种糖能产酸产气，而一些细菌只产酸不产气。如本次试验的大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；而普通变形杆菌只能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变黄色（pH5.2），气体的产生可由倒置的德汉氏

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小管中有无气泡来证明。 三、器材 1．菌种

? 大肠杆菌，普通变形杆菌斜面各一支。

2． 培养基：葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管）。 3． 仪器或其他用具：试管架，接种环等。 四、操作步骤

取葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支，分别接种大肠杆菌和普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。置于37℃培养24～48h后，观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。 五、思考题

假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？

Ⅲ、IMViC与硫化氢试验

一、目的要求

了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道鉴定中的意义和方法。 二、基本原理

IMViC是吲哚、甲基红、伏－普和柠檬酸盐四个试验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。 三、器材 1．菌种

? 大肠杆菌，产气肠杆菌。

2．培养基：蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基。 3．溶液或试剂：甲基红指示剂，40％KOH，5％α－萘酚，乙醚，吲哚试剂等。 四、操作步骤 1．接种与培养

（1）将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中（硫化氢试验）置37℃培养48h。 （2）将上述两菌分别接种于蛋白胨水培养基（吲哚试验）、葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验和伏－普试验）及柠檬酸盐斜面培养基中，置37℃培养2d。 2．结果观察

? 硫化氢试验：观察黑色硫化铅的产生。

? 吲哚试验：培养2d后加入3～4滴乙醚和2滴吲哚试剂，产生红色环状物为阳性反应。

? 甲基红试验：往葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变红为阳性，变黄为阴性。

? 伏－普试验：葡萄糖蛋白胨水培养物内各加入5～10滴的40％KOH和5％α－萘酚溶液，用力振荡后，放入37℃温箱中保温15～30min，若培养物呈红色为伏－普反应阳性。

? 柠檬酸盐试验：观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性。 五、思考题

1．讨论IMViC试验在医学检验上的意义。

2．解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？

3．为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏－普试验最初底物与最终产物有何异同处？为什么会出现不同？

4．说明在硫化氢试验中，醋酸铅的作用，可以用哪种化合物代替醋酸铅？

实验九 微生物的诱发突变

一、目的要求

通过实验观察紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应，并掌握基本方法。 二、基本原理

紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素，它使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二

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聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。

本实验以紫外线作为单因子诱变剂处理产生淀粉酶的枯草芽孢杆菌BF7658，根据诱变后菌株在淀粉培养基上透明圈直径的大小指示诱变效应。 三、器材

1．菌株：枯草芽孢杆菌BF7658。 2．培养基：淀粉培养基。

3．溶液或试剂：碘液，无菌生理盐水，盛4.5ml无菌小试管。

4．仪器或其他用具：1ml无菌吸管，玻璃涂棒，显微镜，紫外线灯（15W），磁力搅拌器，台式离心机，振荡混合器等。 四、操作步骤 1．菌悬液的制备

菌苔需振荡离心（3000r/min，10min）后，制成108个/ml的菌悬液。 2．平板制作

倒27皿淀粉琼脂培养基，凝固备用。 3．紫外线处理

（1）紫外灯预热20min。

（2）菌悬液加入到平皿内，共两皿，同时放入一根无菌搅拌棒。

（3）将上述2个平皿先后置于磁力搅拌器上，打开板盖，在距离30cm，15W的紫外灯下分别搅拌照射1min和3min。（计时从开盖起，加盖止。需先开磁力搅拌器，再开盖照射。） （4）稀释：将照射的菌悬液稀释成10－1～10－6。

（5）涂平板：取10－4～10－6的稀释样品涂布，各3皿。（从紫外线照射处理开始，直到涂布均在红灯下进行）。以同样的操作，取未经紫外线照射的菌液进行稀释涂布作为对照。 （6）培养：将上述平板用黑布包好，置于37℃培养48h。 （7）计数

存活率（％）＝处理后每毫升cfu数/对照每毫升cfu数×100

致死率（％）＝（对照每毫升－cfu数处理后每毫升cfu数）/对照每毫升cfu数×100

（8）观察诱变效应：选取cfu数在5～6的平板滴加碘液数滴，分别测量透明圈直径与菌落直径，并计算其比值（HC比值）。与对照组相比较，说明诱变效果。透明圈越大，淀粉酶活性越强。 五、思考题

1．本实验中用亚硝基胍处理细胞应用了一种简易有效的方法，并减少了操作者与亚硝基胍的接触。能否用本实验结果计算亚硝基胍的致死率？为什么？如果不能，你能设计其他方法来计算致死率吗?

2．1997年8月15日“中国科学报”报道，我国第17颗科学卫星搭载的糖化酶生产菌黑曲霉T101菌株经15d太空“航行”后产生较大变异。科研人员成功选育出糖化酶活力比地面对照株高出20％～30％的菌株。你认为可能的诱变因素是什么？

3．请设计用生长谱法筛选氨基酸缺陷型的简明方案。

实验十 水的细菌学检查 Ⅰ、水中细菌总数的测定

一、目的要求

1．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法； 2．了解水源水的平板菌落计数的原则。 二、基本原理

本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中的细菌种类繁多，因而采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基培养出的细菌总数仅是一种近似值。 三、器材

1．培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水。

2．仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 四、操作步骤 1. 水样的采取

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