最高密度都会因为另一种藻的存在而降低，这是它们对共需的、有限的营养物进行竞争吸收的结果。 三、微生物在自然界物质循环中的作用 碳素循环（carbon cycle） 氮素循环（nitrogen cycle） 硫素循环（sulfur cycle） 磷素循环（phosphor cycle） 铁的循环（iron cycle）

四、细菌沥滤（ bacterial leaching ）或细菌冶金或细菌浸出 溶矿 置换

再生浸矿剂 实验课件

实验一 普通光学显微镜的使用

一、目的要求

1．学习并掌握油镜的原理和使用方法；

2．复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 1．显微镜的基本构造

? 光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。

? 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。 2． 显微镜的放大倍数和分辨率 ? 放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数

? 显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力 D=λ/2n·sin(α/2)

式中：D——物镜分辨出物体两点间的最短距离 λ——可见光的波长（平均0.55mm)

n——物镜和被检标本间介质的折射率 α——镜口角（即入射角）

3．油镜的使用原理

当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、器材 1．菌种

? 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、链霉菌（Streptomyces sp.）、青霉（Penicillium sp.）。

2． 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。

3． 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 四、操作步骤 1．观察前的准备

? 显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。 ? 调节光源 2．显微镜观察 ? 低倍镜观察 ? 高倍镜观察

? 油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 3．显微镜用毕后的处理

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? 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。

五、思考题

1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？

2．试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？

3．什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 4．影响显微镜分辨率的因素有哪些？

5．根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。

实验二 培养基的制备与灭菌

Ⅰ、培养基的制备

一、目的要求

1．明确培养基的配制原理；

2．通过对各类培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、基本原理

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。 三、器材

1．溶液或试剂

? 琼脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl；

? 牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基的配方药品。 2．仪器或其他用具

? 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5.5～9.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 1．称量 2．溶解

3．调节pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。 4．过滤：趁热用四层纱布过滤。 5．分装 6．加塞 7．灭菌 五、思考题

1．培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？ 2．在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？

3．配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入？天然培养基为什么不需要另加微量元素？

4．有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例的基质中，为什么在配制培养基时需要注意各种营养成分的比例？

5．你配制的高氏Ⅰ号培养基有沉淀产生吗？说明产生或未产生的原因。

6．细菌能在高氏Ⅰ号培养基上生长吗？为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施？

7．如果在马丁氏培养基分离真菌时，发现有细菌生长，你认为是什么原因？你将如何进一步分离纯化得到所需要的真菌？

8．马丁氏培养基的pH“自然”，根据你配制前二种培养基的经验和所学知识你认为此培养基灭菌后是应偏酸还是偏碱？为什么？

Ⅱ、灭菌与消毒

一、目的要求

了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

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二、基本原理

灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。 三、器材

培养皿、试管、吸管、电烘箱、牛肉膏蛋白胨培养基，手提式高压蒸气灭菌锅等。 四、操作步骤

1．火焰灼烧灭菌：如接种环或接种针的灭菌 2．干热灭菌 ? 装箱

? 灭菌：160～l70℃ 2h。

? 降温取物：灭菌结束后，切断电源，自然降温至60℃后，取出物品。 3．高压蒸汽灭菌法（以手提式高压蒸汽灭菌锅为例）

? 装锅：先向外层锅内加入适量的水，并装入待灭菌物品。

? 加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。

? 灭菌：加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，升温至l21℃时维持15~20min。 ? 降温取物：灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，开盖取物。 五、思考题

1．在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？

2．为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要地温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。 3．高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

4．在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？ 5．灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？

6．黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个更强？为什么？

实验三 微生物的分离纯化 Ⅰ、微生物的分离与纯化

一、目的要求

掌握倒平板的方法和几种常用的微生物分离纯化的基本操作技术。 二、基本原理

从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 三、器材

1．菌种：米曲霉（Aspergillus oryzae）。

2．培养基：淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。

3．溶液或试剂：10％酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4％水琼脂。 4．仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。

四、操作步骤

1．稀释涂布平板法 ? 倒平板

? 制备土壤稀释液 ? 涂布 ? 培养：将高氏Ⅰ号培养基和马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃培养3～5d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养2～3d。 ? 挑菌落：将培养出的单菌落进行斜面接种，并分别置于25℃和28℃下培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。 2． 平板划线分离法

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? 倒平板 ? 划线

? 挑菌：挑取单个菌落接种到斜面上培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。

五、思考题

1．如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。 2．如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜？并说明其理由。

3．如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？写出简明的实验方案（提示：产蛋白酶菌株在酪素平板上形成降解酪素的透明圈）。

4．为什么高氏I号培养基和马丁氏琼脂培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉菌具有抗性的细菌，你认为应如何做？

5． 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形，而只要划一条直线？

6．接种环（针）接种前后烧灼的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断烧灼过的接种环已冷却？

Ⅱ、微生物的菌落形态特征

一、目的要求

了解各大类微生物的菌落形态特征。 二、基本原理

菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。 三、器材

1．菌种：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。

2．培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号合成培养基和马丁氏培养基等。 3．材料：无菌平皿，接种环(针)。 四、操作步骤

1．平板菌落培养

? 细菌、放线菌、酵母菌采用划线法； ? 霉菌采用点种法。 2．菌落形态观察

实验四 细菌的染色法 Ⅰ、细菌的简单染色法

一、目的要求

1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法； 2．初步认识细菌的形态特征；

3．巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。 二、基本原理

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。 三、器材 1．菌种

? 枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物

? 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）约24h营养琼脂斜面培养物 2． 染色剂：吕式碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。

3． 仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。

四、操作步骤

1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。

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