福州大学《微生物》课件
第一章 绪论
一、什么是微生物？ 二、微生物的特点
1．个体小，面积大 —— 五大共性的基础与关键 2．吸收多，转化快
? 例1：Candida utilis（产朊假丝酵母）合成蛋白质的能力比大豆强100倍，比食用公牛强10万倍。 ? 例2：Escherichia coli（大肠杆菌）在1h内可分解其自身重2000倍的乳糖（约为人类的3,000,000倍）。 3．生长旺，繁殖快
? 例：E.coli在合适条件下每12.5~20min繁殖一代，如按每20min分裂一次，则每1h可分裂3次，每24h可分裂72次，生成4722366500万亿个（重约4722吨）,48h数目为2.2×1043个（约等于4000个地球之重）。 4．适应强，易变异
? 例1：对“极端环境”具有惊人的适应力
? 例2：青霉素产生菌Penicillium chrysogenum（产黄青霉）的产量变异 20U./1943 → 5~100,000U./目前
? 例3：致病菌对抗生素的抗药性变异 Staphlococcus aurreu（金黄色葡萄球菌）：0.02?g / ml / 1943 → 耐药量提高10,000倍 5．分布广，种类多 分布广：“无孔不入”、“无处不在” 种类多：20万种 → 50 ~ 600万种 三、微生物学的发展史 1．史前期
指人类还未见到微生物个体尤其是细菌细胞之前的一段漫长的时期，大约距今8000年前~公元1676年。 代表人物和主要成就 ? 我国劳动人民的酿酒制曲技术 ? 对传染病及其规律的认识 2．初创期 —— 形态学期
1676年列文虎克用自制的单式显微镜观察细菌个体~1861年（近200年）。 代表人物和主要成就：荷兰业余科学家 —— 微生物学先驱者列文虎克 3．奠基期 —— 生理学期
1861年巴斯德根据曲颈瓶试验彻底推翻生命的自然发生说并建立胚种学说 ~ 1897年。 代表人物和主要成就 ? 法国的巴斯德 （1822-1895）—— 微生物学的奠基人、微生物学之父 ? 创立巴氏消毒法（63℃ 30min；72℃ 15sec）。 ? 奠定传染病微生物病原说的基础，发明制造疫苗和预防接种的方法。 ? 否定微生物的自然发生说，建立胚种学说。 ? 德国医生科赫 （1843-1910）—— 细菌学的奠基人 ? 1884年科赫提出确定病原菌的原则 —— 科赫法则。 ? 建立研究微生物的一系列重要方法 ? 建立分离和纯化微生物的平板分离法 4．发展期
1897年德国人E.Buchner用无细胞酵母菌压榨汁中的酒化酶对葡萄糖进行酒精发酵成功，开创微生物生化研究的新时代。 5．成熟期
1953.4.25年J.D.Waston和H.F.C.Crick在英国的《自然》杂志上发表DNA双螺旋模型，生命科学进入分子生物学阶段。
四、微生物学的发展促进了人类进步 1．医疗保健战线上的“六大战役” 2．工业发展过程中的“六个里程碑”
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3．微生物学促进了农业的进步 4．微生物与生态和环境保护的关系
5．微生物学对生物学基础理论研究的贡献 五、微生物学及其分科 1．什么是微生物学？ 2．微生物学的分科
第二章 原核微生物的形态和构造
原核微生物：细胞核无核膜包裹，只存在称作“核区”（拟核）的裸露DNA的原始单细胞生物，不进行有丝分裂，细胞质中无叶绿体、线粒体等细胞器。 三菌三体 ? 三菌：细菌（含古细菌）、放线菌、蓝细菌 ? 三体：支原体、衣原体、立克次氏体
第一节 细菌（ bacterium ）
一、 细菌的形态大小 1．基本形态
球形：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌。 杆状：短杆菌、长杆菌、链杆菌、棒杆菌、梭杆菌。 螺旋形：弧菌、螺菌、螺旋体。 2．特殊形态：三角形、方形、圆盘形等 3．异常形态：畸形和衰颓形 4．细菌大小
测量：在显微镜下用显微测微计（镜台测微尺和目镜测微尺）测量。 长度单位：um（10-6m)、nm（10-9m）（亚细胞结构）、埃（ 10-10m） 表示方法 ? 球菌：直径（0.2-1.5um） ? 杆菌：宽×长（ 0.5-1um × 1-5um ） ? 螺旋菌：宽、长、螺距 二、细菌细胞构造
（一） （一） 细胞壁（ cell wall ）
1． 根据细胞壁结构不同，可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌 ? 肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺（G）和N-乙酰胞壁酸（M）通过β-1,4糖苷键相连。 ? 磷壁酸：分为脂磷壁酸（或称膜磷壁酸）和壁磷壁酸 革兰氏阴性菌 ? 脂多糖（LPS）：G-特有的外膜的主要成分，由O-特异测链（O-多糖，O-Ag， O-specific side chain）、核心多糖（core polysaccharide）和类脂A（lipid A）组成。 2． 革兰氏染色机制
由丹麦医生C.Gram于1884年创立，其基本操作分为初染、媒染、脱色和复染四个步骤。 3． 细胞壁功能
4． 缺壁细菌：L-型细菌、原生质体、支原体 5．古细菌的细胞壁：
成分复杂多样，有的含假肽聚糖、杂多糖，有的以蛋白质为主。 ? 假肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰塔罗糖胺糖醛酸通过β-1,3糖苷键相连。 （二） （二） 细胞膜（又称细胞质膜、质膜或内膜）（ cell membrane ） 1．结构 2．功能
（三） （三） 间体（ mesosome ）
由细胞膜内褶形成的一种囊状结构，其内充满管状或层状的泡囊，多见于G+细菌。每个细胞含一至数个。可
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能与DNA复制、分配及细胞分裂有关。 （四） （四） 细胞质（ cytoplasm ） 1．细胞内含物
异染粒( metachromatic granules )：多聚偏磷酸盐的聚合物，具有贮藏磷元素和能量、降低渗透压的作用。 聚β－羟丁酸（ poly-β-hydroxybutirate，PHB ）：贮存碳源、能源和降低渗透压的作用。 硫粒：硫元素的贮藏体。作为好氧硫细菌的能源和厌氧硫细菌的电子供体。
H2S→S→SO4-2
糖原：淀粉粒和肝糖 脂肪粒
羧酶体( carboxysome )：又称羧化体，含有1,5-二磷酸核酮糖羧化酶，为CO2固定的关键酶。 气泡（ gas vesicles ）：调节细胞比重和吸收空气作用。 2．细胞质功能
（五） （五） 核质体（ nuclear body ）：又称核区、拟核、原核或核基因组。一个大型环状裸露的dsDNA分子。
（六） （六） 糖被（ glycocalyx ） 1．类型：荚膜、菌胶团、粘液层
2．荚膜成分：一般是多糖，少数是多肽或蛋白质，也有多糖与多肽复合型的。 3．荚膜功能：
保护菌体免受干旱损伤； 抵抗宿主白细胞吞噬； 贮藏养料； 堆积代谢废物； 表面附着作用；
多个细菌共处于一个荚膜内，形成菌胶团，具有沉降功能，可用于污水处理； 细菌间的信息识别作用。 4．荚膜与生产实践的关系
? 例1：Leucomostoc mesenteroides 的葡聚糖荚膜已用于生产代血浆的主要成分——右旋糖酐、葡聚糖凝胶制剂；
? 例2：用产菌胶团的菌进行污水处理等；
? 例3：危害 —— 食品变质发粘；增强致病力；造成严重龋齿等。 （七） （七） 质粒（ plasmid ）
核外遗传物质，小型共价闭合环状dsDNA，能够独立复制； 数量不定，0～几十个/细胞，非必不可少；
常带有某些重要功能基因，有些质粒携带抗药性遗传信息； 在遗传工程中可作为目的基因的载体； 易在细胞之间传递。
（八） （八） 鞭毛（ flagellum ）
1．特点：生长在某些细菌表面的长丝状、波曲的蛋白质附属物，具有运动的功能。直径0.01-0.02um，长15-20um. 2．观察方法
直接观察法：电镜、光镜（悬滴法、染色法、暗视野） 间接判断法：半固体穿刺培养、平板菌落形态 3．结构
4．着生方式 5．运动机制
（九） （九） 菌毛（又称纤毛、伞毛、线毛或须毛）( fimbria ) 1．特点：长在细菌体表的一种纤细（直径3-10nm）、中空、短直、数量较多（250-300根）的蛋白质附属物，在革兰氏阴性菌中较为常见。功能是使细菌较牢固地粘附在宿主（呼吸道、消化道、泌尿生殖道的粘膜）表面上。
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2．性菌毛（ pilus ）：在不同性别的菌株间传递DNA片段，有的性菌毛还是RNA噬菌体的特异性吸附受体，常见于革兰氏阴性菌的雄性菌株中。 （十） （十） 芽孢（ endospore ）
1．特点：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆型的抗逆性休眠体，称为芽孢。每个细胞仅形成一个芽孢，无繁殖功能。 2．芽孢类型
3．产芽孢细菌：好氧性的芽孢杆菌属（Bacillus）和厌氧性的梭菌属（Clostridium） 4．芽孢的构造 5．芽孢的形成 6．芽孢的萌发
7．芽孢的抗热机制----渗透调节皮层膨胀学说 （十一）伴孢晶体（ parasporal crystal ）
少数芽孢杆菌（如苏云金芽孢杆菌）在其形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形或双锥形的碱溶性蛋白晶体（即δ-内毒素），称为伴孢晶体。
伴孢晶体是一种毒蛋白，对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫和线虫具有毒杀作用，可作为生物农药。 三、细菌的繁殖方式：裂殖为主 二分裂繁殖（binary fission） 三分裂（trinary fission） 复分裂（multiple fission）：蛭弧菌类 四、细菌的群体形态
（一）在固体培养基上（内）的群体形态
1．菌落（ colony ）和菌苔（ bacterial lawn ） 2．细菌的菌落特征 3．菌落的应用
菌种的分离纯化 菌种的鉴定与保藏 微生物的选种与育种 微生物的计数与测定
（二）在半固体培养基上(内)的群体形态：穿刺接种法
（三）在液体培养基上(内)的群体形态：浑浊、沉淀、气泡、菌膜
第二节 放线菌（ actinomycetes ）
一、放线菌的形态构造：以链霉菌属为例
单细胞，细胞呈丝状分枝，菌丝直径≈细菌直径 菌丝及孢子形态 ? 基内菌丝（营养菌丝，一级菌丝） ? 气生菌丝（二级菌丝） ? 孢子丝 ? 分生孢子
二、放线菌的繁殖方式：横割分裂
细胞膜由外向内凹陷收缩形成横割膜，从而使孢子丝分割成许多原分生孢子，壁膜同时内陷缢缩成一串串成熟分生孢子。
三、放线菌的生活史 四、放线菌的群体特征
菌落特征：干燥、不透明、表面呈紧密的丝绒状，常覆盖一层色彩鲜艳的干粉状孢子；菌落和培养基连接紧密，难以挑取；菌落的正反面颜色常常不一致，以及菌落边缘培养基的平面有变形现象。 液体培养：液清不混而成球或球沉底现象等。
第三节 其他原核微生物
一、蓝细菌（ cyanobacteria ）
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又称蓝藻（blue algae）或蓝绿藻（blue-green algae），一类G-、无鞭毛、含有叶绿素a（不形成叶绿体），好氧，能进行放氧性光合作用的大型（ 3~10?m，60 ?m）原核生物。 进化历史悠久：21-17亿年
分布：广泛，水体、土壤及部分动植物体内外，以及其他恶劣环境（高低温,盐湖,荒漠和冰原等），素有“先锋生物”之美称。
二、支原体（ mycoplasma ）
一类无细胞壁、细胞膜含甾醇，介于独立生活和细胞内寄生生活的最小型原核生物。 菌落：油煎蛋状
繁殖方式：二分裂和出芽 对抗生素敏感性 ? 对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感 ? 对抑制蛋白质合成的四环素与红霉素以及破坏甾体的细胞膜结构的两性霉素与制霉菌素很敏感 生化性质 ? 对渗透压敏感：无细胞壁，只能在等渗或高渗培养基中生长与繁殖； ? 营养需求高：能在含血清、酵母膏和甾醇等营养丰富的培养基上生长； ? 产能代谢：多数能发酵糖类产能； ? 基因组很小：仅在0.6~1.1Mb左右（约为E.coli的1/4~1/5）。 三、衣原体（ chlamydia ）
一类在真核细胞内营专性能量寄生的小型革兰氏阴性原核生物。 衣原体的生活史
四、立克次氏体（ rickettsia ）
一类专性寄生在真核细胞内的革兰氏阴性原核生物。
发现：1909年，美国医生H.T.Ricketts（1871-1910）首次发现落基山斑疹伤寒的独特病原体并被夺去生命，故名。
与支原体的区别：有细胞壁、不能独立生活
与衣原体的区别：细胞较大，无滤过性、存在产能代谢系统
第三章 真核微生物
真核微生物：细胞核具有核膜，能进行有丝分裂，细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器的微小生物。 ? 真菌 ? 酵母菌 ? 霉菌 ? 大型真菌（蕈菌） ? 显微藻类 ? 原生动物
第一节 酵母菌（ yeast ）
一、酵母菌的形态大小 1．细胞大小：2.5~10um × 4.5~21um，约为细菌细胞的5-10倍。 2．细胞形态：球形、椭圆形、卵圆形、柱形、香肠形等。 二、酵母菌的细胞结构
1． 1． 细胞壁（三明治状） 外层—甘露聚糖 中间—蛋白质 内层—葡聚糖
此外含有少量类脂和几丁质。 酵母菌原生质体的制备 ? 蜗牛消化酶：纤维素酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、几丁质酶和脂酶等30余种酶类。 2． 2． 细胞膜：含丰富的麦角甾醇 — 维生素D的前体
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3． 3． 细胞质
4． 4． 细胞核：具有真核（核膜、核仁），核膜是一种双层单位膜，上有核孔。核内有半透明的染色体。 5． 5． 细胞核外遗传物质：线粒体DNA，2um质粒DNA
6． 6． 液泡：具有贮藏营养物和水解酶类、调节渗透压的功能。 7． 7． 微体：圆形或卵圆形，单位膜，参与甲醇与烷烃的氧化。
8． 8． 线粒体：通常呈球状或杆状，具双层膜，内膜向内折叠形成嵴，嵴的两侧均匀地分布基粒。 功能：呼吸代谢的场所。进行氧化磷酸化，为细胞运动、物质代谢、运输提供能量。 ? 酵母：兼性好氧微生物。 ? 有氧条件下，线粒体发育良好，呼吸代谢旺盛。 ? 无氧条件下，线粒体分解为无嵴的、没有氧化磷 酸化功能的线粒体，呼吸代谢微弱。 9． 9． 鞭毛
三、酵母菌的繁殖方式 1．无性繁殖
芽殖：大部分酵母
裂殖：如裂殖酵母属的八孢裂殖酵母
掷孢子：掷孢酵母属等少数酵母菌产生的无性孢子，外形呈肾状。 2．有性繁殖：形成子囊和子囊孢子，如接合酵母属的各种酵母。 3．酵母菌的生活史（生命周期）：上一代生物个体经一系列生长、发育阶段而产生下一代个体的全部过程。 单双倍体型：如酿酒酵母 单倍体型：如八孢裂殖酵母 双倍体型：如路德类酵母 四、酵母菌的菌落特征
与细菌菌落相似，表面湿润、光滑，比细菌菌落大而厚，外观较粘稠，较不透明，多数呈乳白色，少数为红色，个别为黑色；生长在固体培养基表面，易用针挑起；菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位颜色一致；酵母菌的菌落一般还会散发出一股悦人的酒香味。
第二节 丝状真菌—霉菌（mold）
一、霉菌菌丝的形态结构
1． 1． 菌丝类型：真菌营养体的基本单位——菌丝 无隔菌丝 ? 长管状单细胞，多核 ? 生长表现为菌丝的延长和细胞核的增多 ? 低等真菌的菌丝类型 有隔菌丝 ? 多细胞，每个细胞含 一个至多个核， 隔膜上有单孔或多孔， 相邻细胞间可进行物质交换。 ? 高等真菌的菌丝类型 2．真菌菌丝的细胞结构
与酵母菌相似，有完整的细胞核（核膜、核仁、染色体）、线粒体、80S核糖体、内质网、液泡、泡囊、膜边体（类似细菌的间体）。
细胞壁：成分随细胞的不同发育阶段、不同进化地位而改变。 ? 越低等、水生的真菌：以纤维素为主 ? 较高等、陆生的真菌：以几丁质为主
膜边体：位于壁膜间，由单位膜包围或折叠成管状、囊状、球状、卵圆状等，与细菌的间体相似。 二、霉菌菌丝体的分化 1．按功能分
营养菌丝体：密布在培养基基质内，吸收营养物。
气生菌丝体：伸展在空气中，部分气生菌丝体分化成繁殖菌丝，产生孢子。 2．营养菌丝体的特化形态
3．气生菌丝体的特化形态（子实体） 结构简单的子实体
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? 曲霉属和青霉属：分生孢子头 ? 根霉属和毛霉属：孢子囊 ? 担子菌的担子 ：产生有性孢子 结构复杂的子实体 ? 分生孢子器、分生孢子座、分生孢子盘：产生无性孢子 ? 子囊果（闭囊壳、子囊壳、子囊盘）：产生有性孢子 三、霉菌的繁殖方式 1．无性繁殖
菌丝繁殖：菌丝末端延伸生长 孢子繁殖：产生无性孢子 ? 孢囊孢子 ? 分生孢子 ? 节孢子 ? 厚垣孢子 2．有性繁殖
有性繁殖过程 ? 质配、核配、减数分裂 常见的有性孢子 ? 卵孢子 ? 接合孢子 ? 子囊孢子 ? 担孢子
四、霉菌的群体特征 1．菌落特征
菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的蛛网状、绒毛状、棉絮状或毡状；菌落与培养基间的连接紧密，不易挑取，菌落正面与反面的颜色、构造以及边缘与中心的颜色、构造常不一致等。 2．液体培养特征
静止培养：菌丝往往在液体表面生长，液面上形成菌膜。
震荡培养：菌丝可相互缠绕在一起形成菌丝球，亦可形成絮片状，与震荡速度有关。
小结
真菌的生物学特征小结
真核微生物与原核微生物的区别
单细胞微生物与丝状微生物菌落特征的比较 第四章 病毒（ viruses ）
真病毒（病毒）：至少含有核酸和蛋白质两种组分 亚病毒 ? 类病毒：只含有独立侵染性的RNA组分 ? 拟病毒：只含不具独立侵染性的RNA组分 ? 朊病毒：只含单一蛋白质组分
第一节 病毒
一、病毒的特点
形体极其微小：可通过细菌滤器； 没有细胞构造，称为分子生物；
主要成分为蛋白质和核酸（DNA或RNA）； 既无产能酶系也无蛋白质合成系统； 在活细胞内营专性寄生；
对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感；
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有些病毒的核酸可整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。 二、病毒的分类 根据宿主分 ? 微生物病毒 ? 动物病毒 ? 植物病毒 根据核酸类型分 ? DNA病毒(ss DNA, ds DNA) ? RNA病毒(ss RNA, ds RNA) ? RNA DNA病毒(ss RNA, ds DNA) 三、典型病毒粒子的构造 基本构造 —— 核衣壳 ? 核心 ( core )：由DNA或RNA组成 ? 衣壳 ( capsid )：由衣壳粒蛋白组成 非基本构造 ? 包膜（envelope）：类脂双层膜，含蛋白质或糖蛋白 ? 刺突（spike）
四、病毒的对称体制（ virus Symmetry ） 螺旋对称（ helical symmetry）：Tobacco mosaic virus (TMV). 二十面体对称（ icosahedron ）：Adenovirus 复合对称（ complex viruses ）：T4 bacteriophage ? 噬菌体的形状 五、病毒的繁殖方式
Attachment ( adsorption ) 吸附 Penetration ( injection ) 侵入 Replication 增殖 ? Early steps in replication ? Nucleic acid replication ? Synthesis of protein subunits Assembly and packaging 装配 Release 释放（裂解） 六、病毒的群体特征
包涵体（ inclusion body ）：具有一定形态、构造并能用光镜观察和识别的特殊群体。 空斑（ plaque ）：动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成。 枯斑（ lesion ）：植物病毒在植物叶片上形成。 噬菌斑（ plaque ）：一个噬菌斑是由一个噬菌体粒子形成。 ? 噬菌体效价：每ml试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数，又称噬菌斑形成单位数（pfu）或感染中心数。 ? 噬菌体效价的测定方法：双层平板法 ? 成斑率：同一样品根据噬菌斑计算出来的效价与用电镜直接计数得到的效价之比。 七、一步生长曲线（ One step growth curve of virus multiplication ） 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线 三个时期 ? 潜伏期（ latent phase ） ? 隐晦期（ eclipse phase ） ? 胞内累积期（ intracellular accumulation phase ） ? 裂解期（ rise phase ） ? 平稳期（ plateau ） 八、溶源性（ lysogeny ）
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溶源性：温和噬菌体（ temperate phage ）侵入宿主细胞后，基因组整合到宿主的基因组上，并随宿主的复制而进行同步复制，不裂解宿主细胞（溶源菌 lysogen）。
溶源菌：指核染色体组上整合有前噬菌体并能正常生长繁殖而不被裂解的细菌（或其他微生物）。 ? 前噬菌体：整合到宿主核染色体组上的噬菌体核酸。 温和噬菌体 ? 烈性噬菌体与温和噬菌体生活史的比较 ? 温和噬菌体的三态：整合态、营养态、游离态 ? 温和噬菌体的表示方法 ? 例：E.coli K12 ( λ) —— 表示一株带有λ前噬菌体的大肠杆菌K12溶源菌株 溶源菌 ? 特性：裂解性、免疫性、复愈性、溶源转变 ? 溶源菌的检验方法 九、噬菌体与发酵工业
噬菌体污染的判断与检查 预防噬菌体污染的措施 ? 决不使用可疑菌种：溶源菌、不纯菌种 ? 消灭噬菌体：净化环境、控制活菌体排放、加强发酵系统的灭菌 ? 选育和使用抗噬菌体菌株 ? 定期轮换使用不同噬菌体谱系的生产菌种 ? 药物防治：金属螯合剂、抗菌素、表面活性剂等 污染噬菌体后的补救措施 ? 尽快提取产品 ? 使用药物抑制 ? 改用抗噬菌体生产菌株 十、噬菌体在基因工程中的应用
运用DNA的体外操纵技术，把病毒改造成不同外源基因的优良载体，把任何动物、植物或微生物的目的基因导入到合适的受体系统中，从而获得具有新性状的“工程细胞”或“工程菌”。 E.coli Lamda phage：载有外源遗传因子的重组Lamda phage，侵入宿主细胞后，可整合到宿主核基因组上，进行同步复制和表达。
第二节 亚病毒
一、类病毒（ viroid ）
一类只含RNA一种成分、专性活细胞内寄生的分子生物。 只在植物体中发现
1971年瑞士学者T.D.Diener发现马铃薯纺锤形块茎病类病毒PSTD，棒形，ssRNA，闭合环状。 二、拟病毒（ virusoid ）
又称类类病毒、壳内类病毒或病毒卫星，是一类包裹在真病毒粒子（辅助病毒）中的有缺陷的类病毒； 极其微小，一般仅由裸露的RNA（300~400核苷酸）或DNA组成；
1981年Randles等在绒毛烟斑驳病毒VTM0V中发现一种类似类病毒的环状ssRNA分子及其线状形式； 丁型肝炎病毒---拟病毒（含ssRNA），宿主即辅助病毒---乙型肝炎病毒HBV； 拟病毒可干扰辅助病毒的复制和减轻其对宿主的病害，可用于生物防治？ 三、朊病毒（ prion ）
又称“普列昂”或蛋白质侵染因子，是一类不含核酸的传染性蛋白质分子；
1982年美国的S.B.Prusiner发现羊搔痒病的病原体是一种蛋白质，称朊病毒，杆状颗粒，呈丛状排列，直径25nm，长100~200nm；
至今发现与哺乳动物脑部相关的10余种疾病都是由朊病毒引起，如羊瘙痒病、牛海绵状脑病、疯牛病、人的克-雅氏病CJ（早老性痴呆病）、库鲁病（震颤病）等。 ? 特点：病程很慢；都有神经系统退行性症状；脑部出现淀粉样沉淀，形成海绵状空斑。
第五章 微生物的分类与鉴定
微生物分类学（microbial taxonomy）：是一门按微生物的亲缘关系把它们安排成条理清楚的各种分类单
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元或分类群的科学。
具体任务：分类（classification）、鉴定（identification）、命名（nomenclature）。
第一节 微生物的命名
一、通用分类单元
七级分类单元：界(kingdom)、门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)；必要时可在两级之间添加辅助单元，如亚门。这七级分类单元的第一个字母必须大写，而且整个名称用正体字表示。 ? 例：子囊菌纲 Ascomycetes
种：一个基本分类单位，是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。
新种：sp. Nov. 或 nov. sp. 是species novel 的缩写，附在学名后。 二、学名
俗名：普通的、通俗的、地区性的名字。 ? 例：用“结核杆菌”表示“结核分枝杆菌”。
学名：一个菌种的科学名称，是按照《国际细菌命名法则》命名的，国际学术界公认并通用的正式名字。 学名的命名：采用“双名制”的国际植物命名法则。 ? “双名制”是瑞典植物学家林奈（Linneaus）于1953年介绍的植物命名原则，该方法已广泛用于植物、动物、微生物的命名。“双名制”是用两个拉丁文或拉丁化的其他文字组成的一个学名。 三、学名的命名方法
学名由属名和种名组成，书写时：属名+种名；翻译时，种名在前，属名在后；印刷时，学名用斜体字；书写时，在学名下加一横线表示斜体字母。 ? 例：Aspergillus niger 或 Aspergillus niger 属名（曲霉） 种名（黑）
前后有两个或数个学名排在一起时，在属名相同的情况下，后一学名中的属名可缩写成一个大写字母加一句号的形式。 ? 例1：Bacillus（芽孢杆菌属）可缩写成B. ? 例2：若可能产生混淆，也可写成二至三个字母，如：Bac.
属名：表示微生物的主要形态特征、生理特征或以研究者的人名表示。单数，字首大写。 ? 例1：根霉属、毛霉属 —— 形态特征 ? 例2：丙酸杆菌属、乳酸杆菌属 —— 生理特征+形态特征 ? 例3：沙门氏杆菌属 —— 研究者的人名 + 形态特征
种名：说明微生物的颜色、形状、用途，有时用人名、地名、微生物寄生的宿主名称和致病的性质来表示。字母小写。 ? 例1：黑曲霉 —— 颜色 ? 例2：巴斯德酵母 —— 人名 ? 例3：北京棒杆菌 —— 地名 ? 例4：猪霍乱沙门氏菌 —— 寄生的宿主名称和致病性质 ? 例5：种名未确定：属名加 sp.（单数）或 spp.（复数）表示。如：Bacillus sp.表示一种芽孢杆菌；Bacillus spp. 表示若干芽孢杆菌 亚种、变种的命名 ? 亚种：subspecies，简称“subsp.” ? 变种：variety，简称“var.” ? 命名：三名法
属名 + 种名 + （subsp.或var.）+ 亚种（或变种） 可省略 ? 例1：Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus 酿酒酵母椭圆变种 ? 例2：Bacteroides fragilis subsp. Ovatus 脆弱拟杆菌卵形亚种 新种的命名 ? 新种：属名 + 种名 + sp.nov.
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? 例：Corymebacterium pekinense sp. Nov. AS 1.229 北京棒杆菌AS1.229新种 菌株 ? 菌株（在病毒中称毒株）：表示任何由一个独立分离的单细胞（或单个病毒粒子）繁殖而成的纯种群体及其一切后代。一种微生物的每一不同来源的纯培养物均可称为该菌种的一个菌株。菌株的名称放在学名的后面，可用字母、符号、编号、研究机构或菌种保藏机构的缩写来表示。 定名人、定名年份的表示 ? 属名 + 种名 + （首次定名人）+ 现名定名人 + 定名年份 ? 例1：Escherichia coli (Migula) Castellani et Chalmers 1919 大肠杆菌 ? 例2：Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn 1872 枯草芽孢杆菌
第二节 生物的界级分类学说
二界系统 ? 植物界和动物界 三界系统 ? 1866年E.N.Haeckel提出动物界、植物界和原生生物界（单细胞生物、无核类）。 四界系统 ? 1956年Copeland提出植物界、动物界、原始生物界（原生动物、真菌、部分藻类）和菌界（细菌、蓝细菌）。 五界系统 ? 1969年R.H.Whittaker提出动物界、植物界、原生生物界（原生动物、单细胞藻类、粘菌等）、真菌界（真菌和酵母）、原核生物界。 六界系统 ? 1977年我国学者王大耜在Whittaker五界系统基础上增加病毒界。 三总界五界系统 ? 我国学者陈世骧提出非细胞总界、原核总界（细菌界和蓝细菌界）、真核总界（植物界、真菌界、动物界）。
三原界系统 ? 1978年R.H.Whittaker和L.Margulis提出古细菌原界、真细菌原界、真核生物原界。
第三节 微生物的鉴定
Conventional taxonomy（分类学） ? Morphology, biology, physiology & ecology Molecular taxonomy ? DNA base composition-GC ratios（GC比例） ? DNA:DNA hybridization（DNA-DNA分子杂交） ? Ribotyping（16S rRNA寡核苷酸编目分析） ? FAME analysis（脂肪酸分析） ? Numerical taxonomy（数值分类法） Conclusion ? A prokaryote whose 16S rRNA sequence differs by more than 3% from that of all other organisms (that is, the sequence is less than 97% identical to any other sequence) should be considered a new species； ? Greater than 5-7% difference in 16S rRNA gene sequence to be different genus； ? 70% DNA:DNA hybridization for the same species； ? 20% DNA:DNA hybridization maybe for the same genus。
第六章 微生物的营养和培养基
营养（nutrition）：指生物体从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，以满足其生长和繁殖需要的一种生理功能。
营养物（nutrient）：指具有营养功能的物质，在微生物学中，常常还包括光能这种非物质形式的能源在内。
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微生物的营养物可为它们正常生命活动提供结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。
第一节 微生物的六种营养要素
一、碳源（ carbon source ）：凡能提供微生物营养所需的C元素（C架）的营养源。 无机C源：CO2和碳酸盐——自养型微生物的C源
有机C源：碳水化合物及其衍生物、有机酸、烃类、脂类等。 ? 异养型微生物：糖类最易利用，其次是醇类、有机酸类和脂类等。 ? 糖类：最易利用。 ? 己糖>戊糖 ? 单糖>双糖、多糖 ? 淀粉>纤维素、几丁质 ? 纯多糖>杂多糖和其他聚合物（木质素） 常用C源 ? 实验室培养基：葡萄糖、蔗糖 ? 生产：淀粉质原料（山芋粉、玉米粉、大米） 新C源的开发 ? 农副产品和工业废弃物的利用：废糖蜜、米糠、麸皮、木屑、黄浆水等。 ? 利用石油及烃类作为C源和能源：注意毒性问题。 二、氮源（ nitrogen source ）：凡能提供微生物生长繁殖所需N元素的营养源。 无机N源：N2和含N的无机盐，如硝酸盐、铵盐、氨水等。 ? N2：难利用。 ? 铵盐：利用普遍、效率高，直接参与细胞内物质合成。 ? 硝酸盐：利用效率较低，NO3-先还原成NH4+后，再参与物质合成。 ? 使用无机N源，需配合使用pH缓冲剂 ? 硫酸铵：生理酸性盐，NH4+利用后，pH↓ ? 硝酸钾：生理碱性盐，NO3-利用后，pH↑ ? 硝酸铵：生理中性盐，利用后，pH不变（ pH先↓后↑）。 有机N源：氨基酸、蛋白质、嘌呤碱、嘧啶碱、蛋白胨、牛肉膏等。 ? 氨基酸：微生物能较好利用，直接参与胞内转氨脱羧。 ? 氨基酸自养型微生物：非氨基酸类的简单N源→自行合成所需氨基酸（所有植物和许多微生物） ? 氨基酸异养型微生物：利用现成氨基酸作N源（所有动物和大量异养微生物）。 ? 蛋白质（如花生饼粉、豆饼粉）：微生物分泌胞外蛋白酶水解后方可利用，利用速度慢。一般来说，如果在蛋白质中加入微量蛋白胨，微生物利用了蛋白胨，并释放出蛋白酶，便可分解利用蛋白质。 ? 迟效性N源：含蛋白质的有机N源。 ? 速效性N源：无机N源或以蛋白质的各种降解产物形式存在的有机N源。 常用N源 ? 实验室：铵盐、硝酸盐、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏。 ? 生产上：硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、玉米浆 三、能源（ energy source ）：能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 辐射能：光能自养和光能异养微生物的能源 化学物质 ? 有机物：化能异养微生物的能源（同碳源） ? 无机物：化能自养微生物的能源（一些还原态的无机物质，如NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+等） 四、 生长因子（ growth factor ）：微生物正常代谢所必不可少且不能用简单的C源或N源自行合成的微量有机物质（狭义的生长因子一般指维生素）。
生长因子自养型微生物：不需外界提供生长因子 生长因子异养型微生物：需要多种生长因子 营养缺陷型：缺乏合成生长因子能力的微生物。
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? 供给方式 ? 直接在培养基中添加所需生长因子，如Lys- ? 添加天然营养物质提供齐全成分，如酵母膏等。
生长因子过量合成微生物：分泌出大量生长因子，可作为维生素等的生产菌。 五、无机盐
大量元素：所需浓度在10-3~10-4 mol/l，如P、S、K、Ca、Na、Mg、Fe等。 ? 供给方式：配制培养基时，加入有关化学试剂，其中MgSO4、K2HPO4可以提供需要量最大的四种元素。
微量元素：所需浓度在10-6~10-8mol/l，如Cu、Zn、Mn、Mo、Co等。 ? 供给方式：在一般化学试剂、天然水、玻璃器皿或其他天然成分中都以杂质等状态存在，在配制培养基时，无需另行加入。过量或配比不当，会产生毒害作用。 无机盐的生理功能 六、水
微生物细胞的重要组成成分，其含量可达70~95%（细菌~80%，酵母~75%，霉菌~85%）。 水是优良的溶剂和细胞内进行各种生化反应的媒介。
水可维持生物大分子结构的稳定，并参与某些重要的生物化学反应。
第二节 微生物的营养类型
根据C源性质，可以把微生物分为： ? 自养型：不依赖任何有机营养物即可正常生活的微生物。 ? 异养型：至少需要提供一种大量有机物才能满足其正常营养要求的微生物，即其C源必须是有机物，氢供体是有机物，能源则可以利用氧化有机物或吸收日光能获得。 根据能源性质，可以把微生物分为： ? 光能型：利用光能进行光合作用以获得能量。 ? 化能型：能源来自于有机物或无机物氧化所产生的能量 微生物的四种营养类型 营养类型光能自养型（光能无机营养型）光能异养型（光能有机营养型）化能自养型（化能无机营养型）化能异养型（化能有机营养型）能源光光无机物（还原态*）氢供体无机物有机物无机物有机物基本碳源CO2CO2及简单有机物CO2 有机物实例蓝细菌藻类红螺菌科铁细菌氢细菌绝大多数细菌和全部真核微生物有机物* NH4 、NO2-、S 、H2 、H2S 、Fe2+第三节 营养物质进入细胞的方式
细胞膜上无载体蛋白：单纯扩散（物理扩散、被动运送） 细胞膜上有载体蛋白 ? 不耗能量：促进扩散 ? 消耗能量
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? 运送前后溶质分子不变：主动运送 ? 运送前后溶质分子改变：基团移位 四种运送方式的比较
比较项目特异性载体蛋白单纯扩散无慢由浓至稀相等无特异性不需要不变无无竞争性无促进扩散有快由浓至稀相等特异性不需要不变有有竞争性有主动运送有快由稀至浓内部浓度高基团移位有快由稀至浓内部浓度高运送速度溶质运送方向平衡时内外浓度运送分子能量消耗运送前后溶质分子特异性需要不变有有竞争性有第四节 培养基
特异性需要改变有有竞争性有
载体饱和性与溶质类似物运送抑制剂
一、培养基
一种人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。因此任何培养基都应具备微生物所需的六大营养要素，且其间的比例是合适的。 二、选用和设计培养基的四个原则 1．目的明确 2．营养协调
C/N比 = C源中C原子摩尔数 / N源中N原子摩尔数 3． 经济节约
4． 物理化学条件适宜：pH、渗透压、水活度和氧化还原电势 pH值 ? 微生物生长的最适pH值不同。 ? 细菌： pH7.0~8.0，放线菌： pH7.5~8.5，酵母菌： pH3.8~6.0，霉菌： pH4.0~5.8 ? 微生物生长代谢过程中，会引起培养基pH的变化。 ? 调节 ? 内源调节：加磷酸缓冲液；加CaCO3 或 NaHCO3 ? 外源调节：按实际需要流加酸液或碱液 渗透压（ osmotic pressure ）：由于溶质浓度差而在细胞膜两侧造成的压力差。渗透压的大小与溶液中分子或离子的质点数有关。等重的物质，其分子或离子越小，则质点数越多，渗透压越大。 ? 低渗溶液：外界浓度低，细胞吸水膨胀。 ? 等渗溶液：适宜微生物生长。 ? 高渗溶液：外界浓度高，细胞失水，发生质壁分离。
水活度aw：表示在天然环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。 氧化还原电势Eh：一般用伏特表示。 ? 环境中的Eh与氧分压、pH的关系： ? 氧分压↑， Eh值↑； 氢分压↑， Eh值↓； ? pH↑， Eh值↓； pH↓， Eh值↑。
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? 微生物的代谢活动引起培养基的最初Eh值逐步下降： ? 耗氧，使Eh值↓；对有机物氧化，使Eh值↓； ? 代谢过程产生的H2、H2S等还原物质使Eh值↓。 ? 各种微生物对培养基中Eh值的要求： ? 适宜好氧微生物生长的Eh值：0.3~0.4V，Eh值>0.1V，均能生长； ? 兼性厌氧微生物：>0.1V 好氧呼吸，< 0.1V 发酵； ? 厌氧微生物：< 0.1V 才能生长。
三、选用和设计培养基的四个方法：生态模拟、查阅文献、精心设计、试验比较 四、培养基的种类
1．根据培养基的成分分
天然培养基（ complex medium或undefined medium ）：利用动植物或微生物或其提取物制成的培养基，人们无法确切知道其中的成分。 ? 例：培养细菌的肉汤蛋白胨培养基、培养酵母菌的麦芽汁培养基。 组合培养基（合成培养基或综合培养基）（ defined medium ）：一类用多种高纯化学试剂配制成的、各成分的量都确切知道的培养基。 ? 例：培养放线菌的高氏一号培养基、培养霉菌的察氏培养基。 半组合培养基（ emi-defined medium ）：既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。 ? 例：培养真菌的马铃薯蔗糖培养基 2．根据培养基外观的物理状态分 液体培养基（ liquid medium ）
半固体培养基（ semi-solid medium ）：液体培养基 + 0.2 ~ 0.5%琼脂 固体培养基（ solid medium ） ? 凝固培养基：液体培养基+1.5~2%琼脂（5~12%明胶） ? 非可逆性凝固培养基：用血清或硅胶作凝固剂 ? 天然固体培养基：用麸皮、米糠、木屑等配制而成 ? 滤膜：醋酸纤维薄膜 3．根据培养基功能分
选择性培养基（ selected medium ）：根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学物理因素的抗性而设计的培养基，其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。
如酵母富集培养基中的孟加拉红抑制细菌的生长而对酵母菌无影响，偏酸性的环境有利于酵母菌的生长。
? 方法：投其所好，取其所抗。 鉴别性培养基（ differential medium ）：培养基中加有能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼就能使该菌菌落与外形相似的它种菌落相区分的培养基。 ? 例：伊红美蓝乳糖培养基（EMB培养基）——鉴别肠道菌。
第七章 微生物的代谢与发酵
新陈代谢（或代谢）（ metabolism ）：指发生在活细胞中的各种分解代谢和合成代谢的总和。 ? 新陈代谢 = 分解代谢 + 合成代谢
微生物的能量代谢：中心任务是生物体如何把外界环境中多种形式的最初能源转换成对一切生命活动都能使用的通用能源 — ATP 。
生物氧化：发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总称。 ? 生物氧化与燃烧的比较 ? 自养微生物的生物氧化 ? 化能自养菌：还原CO2而需要的ATP和还原力[H]通过氧化无机底物（NH4+、NO2-、H2S、S0、H2和Fe2+等）来实现。其产能途径主要是借助于经过呼吸链的氧化磷酸化反应，因此，绝大多数化能自养菌是好氧菌。 ? 光能自养菌
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? 产氧：真核生物 —— 藻类及其他绿色植物；原核生物 —— 蓝细菌 ? 不产氧（仅原核生物有）：光合细菌 ? 产能途径 ? 循环光合磷酸化 ? 非循环光合磷酸化 ? 嗜盐菌紫膜的光合作用 ? 自养微生物的CO2固定 ? Calvin循环：光能自养生物合化能自养生物固定CO2的主要途径。 ? 厌氧乙酰-CoA途径：一些能利用氢的严格厌氧菌包括产甲烷菌、硫酸盐还原菌和产乙酸菌中发现的新的自养CO2还原途径。 ? 还原性TCA循环途径：少数光合细菌如嗜硫代硫酸盐绿菌固定CO2的途径。 ? 化能异养微生物的生物氧化 ? 生物氧化的过程：脱氢（或电子）、递氢（或电子）、受氢（或电子） ? 生物氧化的功能：产能（ATP）、产还原力［H］、产小分子中间代谢物 ? 根据递氢特别是受氢过程中氢受体性质的不同，可以把生物氧化区分成三种类型：呼吸（有氧呼吸）、无氧呼吸、发酵
呼吸（ respiration ）或有氧呼吸：一种最普遍和最重要的生物氧化方式。其特点是底物按常规方式脱氢后，经完整的呼吸链（或电子传递链）递氢，最终由分子氧接受氢并产生水和释放能量（ATP）。
无氧呼吸（ anaerobic respiration ）或厌氧呼吸：一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物（个别为有机氧化物）的 生物氧化。这是一类在无氧条件下进行的产能效率较低的特殊呼吸。其特点是底物按常规途径脱氢后，经部分呼吸链递氢，最终由氧化态的无机物（个别是有机物延胡索酸）受氢。 ? 硝酸盐呼吸( nitrate respiration )或反硝化作用 ? 能进行硝酸盐呼吸的都是一些兼性厌氧微生物（即反硝化细菌），如地衣芽孢杆菌等。 ? 反硝化细菌具有完整的呼吸链，只有在无氧条件下，才能诱导出反硝化作用所需的硝酸盐还原酶A和亚硝酸还原酶。 ? 硫酸盐呼吸( sulfate respiration ) ? 硫酸盐还原菌都是一些严格依赖于无氧环境的专性厌氧细菌。如脱硫脱硫弧菌。 ? 硫呼吸( sulphur respiration ) ? 能进行硫呼吸的微生物只有氧化乙酸脱硫单胞菌。 ? 碳酸盐呼吸( carbonate respiration ) ? 产甲烷菌产生甲烷的碳酸盐呼吸 ? 产乙酸细菌产生乙酸的碳酸盐呼吸 ? 延胡索酸呼吸( fumarate respiration ) ? 许多兼性厌氧细菌，如埃希氏杆菌属。 发酵（ fermentation ）：在生物氧化或能量代谢中，发酵指在无氧条件下，底物脱氢后所产生的还原力[H]不经过呼吸链传递而直接交给某一内源氧化性中间代谢产物的一类低效产能反应。 ? 由EMP途径中丙酮酸出发的发酵 ? 酵母型酒精发酵 ? 同型乳酸发酵 ? 丙酸发酵 ? 混合酸发酵 ? 丁酸型发酵 ? 丙酮丁醇发酵 ? 通过HMP途径的发酵 — 异型乳酸发酵 ? 通过ED途径进行的发酵 — 细菌的酒精发酵 ? 酵母的“同型酒精发酵”：由酿酒酵母等通过EMP途径进行。 ? 葡萄糖 + 2ADP + 2Pi → 2乙醇 + 2CO2 + 2ATP ? 细菌的“同型酒精发酵”：由运动发酵单胞菌等通过ED途径进行。 ? 葡萄糖 + ADP + Pi → 2乙醇 + 2CO2 + ATP
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? 细菌的“异型酒精发酵”：由Leuconostoc mesenteroides等通过HMP途径进行。 ? 葡萄糖 + ADP + Pi → 乳酸 + 乙醇 + CO2 + ATP ? 氨基酸发酵产能 — Stickland反应：以一种氨基酸作氢供体和以另一种氨基酸作氢受体而产能的独特发酵类型。产能效率很低，每分子氨基酸仅产生1个ATP。
第八章 微生物的生长及其控制
个体生长：同化作用速度超过异化作用，原生质总量（重量、体积、大小）不断增加，出现个体生长。 ? 个体生长 → 个体繁殖 → 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
微生物学中的 “生长” 均指群体生长。
第一节 测定生长繁殖的方法
一、测定生长量的方法 1．直接法
测体积：适用于菌量大的样品，初步比较用。 ? 将待测培养液置于刻度离心管中→沉降或离心→计算菌体体积（包括细胞体积和细胞之间的空隙体积）
称干重：适用于菌量大的样品。 ? 离心法：离心 → 干燥[ 100~105℃或红外线烘干或真空干燥 （40℃或80℃）]→称干重 ? 过滤法：过滤（滤纸或醋酸纤维膜过滤）→ 洗涤 → 真空干燥（40℃）→ 称干重 2．间接法
比浊法：波长为450~650nm ? 原生质含量↑ → 培养液浊度↑； ? 用分光光度计测出待测培养液的浊度，对照标准曲线，求出菌浓度，结果为相对值； ? 不适用于含非细胞固形物多的样品和丝状微生物。
生理指标法：测含氮量，含碳量，P、DNA、RNA、ATP、DAP、N-乙酰胞壁酸的含量。 二、计繁殖数 1．直接法
血球计数板法（ counting chamber ）：全菌计数法 ? 用血球计数板在显微镜下直接计数。 活菌染色计数法 ? 用美蓝液对酵母菌染色，活细胞为无色，死细胞为蓝色； ? 细菌经吖啶橙染色后，在紫外光显微镜下可观察到活细胞发出橙色荧光，死细胞发出绿色荧光。 2．间接法
平板菌落计数法（ plate counting ）：不适用于严格厌氧菌，活菌计数法 ? 平板表面涂布法（ spread-plate method ） ? 琼脂培养基浇注法（ pour plate method ）
第二节 微生物的生长规律
一、同步生长：细胞群体处于分裂步调一致的状态。 1．获得同步生长的方法 环境条件诱导法 ? 改变环境条件，用控制温度、光线、培养基成分、或者用能够影响细胞周期中主要功能的代谢抑制剂等条件，诱导同步生长。
机械筛选法：选择性过滤法、密度梯度离心法或膜洗脱法等。 ? 原理：在非同步生长的微生物中，微生物处于不同的生长阶段，体积、大小和重量不一，可用不同孔径的滤膜过滤或密度梯度离心，选出同一生长阶段的微生物。 2．同步生长曲线 —— 阶跃性曲线
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二、单细胞微生物的典型生长曲线
把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的条件下，它们的群体就会有规律的生长起来。以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就得到微生物的典型生长曲线。 根据微生物的生长速率常数R不同，可分为： ? Lag phase（延滞期、调整期、适应期） ? Exponential phase（指数期、对数期） ? Stationary phase（稳定期、平衡期） ? Death phase（衰亡期） 1．延滞期 特点 ? 生长速率常数R = 0 ? 细胞形态变大或增长 ? 细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈碱性。 ? 合成代谢活跃，易产生诱导酶。 ? 对外界不良条件反应敏感 影响因素 ? 菌种特性 ? 接种龄 ? 接种量 ? 培养基成分 2．对数期 特点 ? R最大，增代时间（代时G）或倍增时间最短。 ? 细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀。 ? 酶系活跃，代谢旺盛。 影响因素 ? 菌种特性 ? 营养成分 ? 营养物浓度 ? 培养温度 3．稳定期 特点 ? R = 0，菌体产量达到最高点。 ? 细胞开始储存糖原、异染颗粒和脂肪等储藏物。 ? 以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期。 稳定期到来的原因 ? 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； ? 营养物的比例失调； ? 有害代谢产物累积； ? pH、氧化还原电势等物化条件不适宜。 4．衰亡期 特点 ? 个体死亡速度 > 新生速度，群体呈现负生长； ? 细胞形态多样； ? 细胞产生自溶； ? 产生或释放抗生素； ? 芽孢杆菌中芽孢的释放。 衰亡期到来的原因 ? 环境条件越来越不利，从而引起细胞内分解代谢大大超过合成代谢，导致菌体死亡。
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三、微生物的连续培养（continuous culure ）
当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流进新鲜培养基，并立即搅拌均匀；另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。这样，培养物就达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上。 1．恒浊器（ turbidostat ）：根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。 2．恒化器（ chemostat ）：一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。 3．恒化器与恒浊器的比较 4．连续培养的优缺点 优点 ? 高效、自控 ? 节约了大量动力、人力、水和蒸汽 ? 产品质量较稳定 缺点 ? 菌种易于退化 ? 易遭杂菌污染 ? 营养物的利用率低
第三节 影响微生物生长的主要因素
一、温度
生长温度三基点 ? 最低生长温度：一般为-5~ -10℃，极端为-30℃ ? 最适生长温度 ? 嗜冷菌：＜20℃（一般为15℃） ? 中温菌：20~45℃（室温菌：约25℃；体温菌：约37℃） ? 嗜热菌：＞45℃（一般为50~60℃） ? 最高生长温度：一般为80~95℃，极端为105~150℃
最适生长温度：分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。
最适生长温度≠发酵速度最高时的培养温度≠代谢产物量最高时的温度≠生长量最高时温度 二、氧气
根据微生物与氧的关系，可分为： ? 好氧菌 ? 专性好氧菌：需氧，在正常大气压（0.2巴）下通过呼吸产能。 ? 兼性厌氧菌：以呼吸为主，兼营发酵产能；以呼吸为主，兼营厌氧呼吸产能。 ? 微好氧菌：只能在0.01~0.03巴的大气压下生活。 ? 厌氧菌 ? 耐氧菌：不需氧，只能以发酵产能，氧无毒害。 ? （专性）厌氧菌：氧有害或致死，以发酵或无氧呼吸产能。 ? SOD功能是保护好氧菌免受超氧化物阴离子自由基的毒害。 厌氧菌的氧毒害机制
三、pH值：-lg[H+]，指外界环境的pH值 不同微生物的生长pH范围不同；
微生物在生命活动过程中，会改变外界环境中的pH值； pH的调节方法。
第四节 有害微生物的控制
一、几个基本概念
灭菌（ sterilization ）
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消毒（ disinfection ） 防腐（ antisepsis ） 化疗（ chemotherapy ） 二、高温灭菌
1．干热灭菌法（ dry heat sterilization ） 火焰灼烧法：直接在火焰上灼烧灭菌。
烘箱内热空气灭菌法：160℃ 2h，适用于耐高温器皿。 2．湿热灭菌法（ moist heat sterilization ）
煮沸消毒法：一般用于饮用水的消毒，100℃下煮沸数分钟。 巴氏消毒法（ pasteurization ）
间歇灭菌法（ fractional sterilization ）：适用于不耐热培养基。 加压灭菌法（ autoclave ）：121℃（压力1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15~20min。 3．影响加压蒸汽灭菌效果的因素
灭菌物体的含菌量：含菌量↑，灭菌时间↑
灭菌对象的pH： pH<6，微生物易死亡； pH6.0~8.0，微生物不易死亡 灭菌对象的体积：影响热传导率 加热与散热速度
灭菌锅内空气排除程度的影响：加压蒸汽灭菌不是靠蒸汽压力，而是靠蒸汽温度，灭菌时要先排尽锅内空气，否则压力表上压力= 锅内水蒸汽压力+空气压力 4．高温对培养基成分的影响 形成沉淀物 ? 牛肉膏、蛋白胨、麦芽汁等天然培养基灭菌后，发生沉淀（一般不影响微生物生长）。 ? 培养基中含Ca、Mg、Fe、Zn等离子，加热后易形成磷酸盐、碳酸盐沉淀。 破坏营养，提高色泽 ? 褐变：含糖较高的培养基灭菌后，颜色发生变化，如黄、褐色，一般颜色越深，发酵效果越差。 ? 原因：还原糖的羰基与氨基酸或蛋白质的氨基反应 → 氨基糖（褐色）；部份糖分解 → 焦糖 改变培养基pH：灭菌后，培养基pH下降0.2~0.3 降低培养基浓度：气温低时会增加冷凝水 三、过滤除菌法（ filter sterilization ） 四、常用的消毒防腐剂及其应用
最低抑菌浓度（ Minimum inhibitory concentration-MIC ） MIC的测定方法 ? Tube dilution technique ? Agar diffusion technique
第九章 微生物的遗传育种
几个基本概念 ? 遗传( heredity ) ? 表型( phenotype ) ? 变异( variation ) ? 饰变( modification )
第一节 遗传变异的物质基础
一、三个经典实验
1．肺炎链球菌的转化实验 1928，Fred Griffith discovered the phenomenon of transformation in Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌） He proposed the concept of transforming principle Discovery of DNA as genetic material 2．噬菌体的感染实验
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1952, Hershey and Chase, demonstrated conclusively that DNA is the genetic material by using radioactively labeled phage virus T2 as experimental model Phage infection ? Attachment to cell surface ? Injection of genetic materials into host cell ? Direct the host cell to make new virus particles 3．植物病毒的重建实验 1956，H. Fraenkel-Conrat 二、核酸在胞内存在的七个水平
细胞水平：单细胞与多细胞、性细胞与体细胞和单核与多核细胞 细胞核水平：真核与原核、核内与核外和单核与多核等
染色体水平：一份染色体与多份染色体及染色体基因组的大小等 核酸水平：是DNA还是RNA、是复合还是露裸及是长还是短等 基因水平：依基因功能可分为结构基因及调控基因等 密码子水平：由结构密码子及起始与终业密码等 碱基水平：突变的最低交换单位有A、T、G、C等 三、遗传物质类型
第二节 基因突变和诱变育种
一、基因突变或突变（ gene mutation ） 1．突变类型
形态突变型 ( morphological mutant ) 抗原突变型 ( antigenic mutant ) 产量突变型 ( producing mutant )
条件致死突变型 ( conditional lethal mutant ) 抗性突变型 ( resistant mutant ) 营养缺陷型 ( auxotroph ) ? 野生型 ( wild type )：从自然界分离到的在发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。 ? 原养型 ( prototroph )：营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。
2．突变率（ mutation rate ）
每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变一般是独立发生的，双重突变的几率是各个突变几率的乘积。
3．基因突变的特点
不对称性 ：突变性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。 自发性：突变可以在没有人为的诱变因素处理下自发产生。 稀有性：突变率极低。
独立性：突变的发生一般是独立的。
诱变性：通过诱变剂的作用提高自发突变几率。 稳定性：新的诱变性状是稳定的、可遗传的。 可逆性：任何性状都可发生正向突变和回复突变。 4．基因突变的自发性与不对称性的证明 变量试验（ fluctuation test ）
涂布试验（ newcombe experiment ） 平板影印培养试验（ replica plating ） 二、UV对DNA的损伤及其修复 UV的作用机制 ? 使同链DNA的相邻嘧啶形成共价结合的嘧啶二聚体，减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。 光复活作用
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? 把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象。所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射和后续操作，并在黑暗条件下培养。 暗修复作用（切除修复） ? 活细胞内一种用于修复被UV等诱变剂（包括烷化剂、X射线和γ射线等）损伤后的DNA的机制。 三、菌种选育 1．选种
从自然界中选种 ? 样品采集 ? 增殖培养（富集培养） ? 分离纯化：平板划线分离法、平板表面涂布法、琼脂培养基浇注法。 从生产中选种
2． 定向培育优良菌株
一种利用微生物的自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的方法。 ? 例：卡介苗就是通过对结核分枝杆菌进行长期定向培育获得成功的例子。 3．诱变育种
诱变育种的基本环节 诱变育种的基本步骤 ? 选择简便有效的诱变剂 ? 物理诱变剂：UV、激光；X射线、γ射线和快中子 ? 化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物 ? 挑选优良的出发菌株（用于育种的原始菌株） ? 处理单孢子（或单细胞）悬液 ? 选用最适的诱变剂量 ? UV剂量指强度与作用时间的乘积。在育种实践中，常以杀菌率作为诱变剂的相对剂量，多采用杀菌率为70~75%甚至更低（30~70%）的相对剂量。 ? 充分利用复合处理的协同效应 ? 设计或采用高效筛选方案或方法 ? 初筛：以量（选留菌株的数量）为主，利用和创造形态、生理与产量间的相关指标，可在培养皿或摇瓶中进行。 ? 复筛：以质（测定数据的精确度）为主，一般采用摇瓶培养或台式发酵罐进行发酵，然后对培养液进行分析测定，选出较理想的菌种。 四、营养缺陷型（ auxotroph ）的筛选 1．诱变剂处理
2．淘汰野生型，“浓缩”营养缺陷型 细菌：青霉素法 真菌：制霉菌素法
丝状菌（真菌或放线菌）：菌丝过滤法 3．检出缺陷型 夹层培养法 限量补充培养法 影印平板法 逐个检出法
4． 鉴定缺陷型：生长谱法
第三节 基因重组（gene recombination）
原核微生物的基因重组：转化、转导、接合、原生质体融合等。
真核微生物的基因重组：有性杂交、准性杂交、转化、原生质体融合等。
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1． 转化（ transformation ） 2． 转导（ transduction ）
普遍转导（ generalized transduction ） ? 媒介：温和噬菌体 ? 方式 ? 完全普遍转导 ? 流产普遍转导
局限转导（ specialized transduction ） ? 缺陷噬菌体的形成方式：脱离宿主核染色体时，发生低频率的误切。 3. 接合（ conjugation ） 四种不同接合型菌株 ? F+菌株（雄性菌株） ? F-菌株（雌性菌株） ? Hfr菌株（高频重组菌株） ? F’菌株
4．原生质体融合（ protoplast fusion ） 5．有性杂交（ sexual hybridization ） 6．准性杂交（ parasexual hybridization ） 7．基因工程（ gene engineering ） 基因工程的基本操作 ? 目的基因的获得 ? 载体的选择 ? 目的基因与载体DNA的体外重组 ? 重组载体引入受体细胞 基因工程的应用和发展前景 ? 基因工程在工业上的应用 ? 基因工程在农业上的应用 ? 基因工程在医疗上的应用 ? 基因工程在环境保护中的应用 ? 基因工程与基本理论研究
第四节 菌种的衰退、复壮和保藏
1．菌种的衰退
菌种衰退的表现 ? 菌落和细胞形态的改变 ? 生长速度缓慢，产孢子越来越少 ? 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降 ? 抗不良环境条件能力的减弱 菌种衰退的防止 ? 控制传代次数，采用有效的菌种保藏方法 ? 创造良好的培养条件 ? 利用不同类型的细胞进行接种传代 2．菌种复壮
狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施。
广义：在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种
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的生产性能逐步有所提高。 菌种复壮的方法 ? 纯种分离：平板表面涂布法、平板划线分离法、琼脂培养基浇注法 ? 通过宿主体内生长进行复壮 ? 淘汰已衰退的个体 3．菌种保藏
几种常用保藏方法的比较
第十章 微生物的生态
一、微生物在自然界中的分布
土壤中微生物：土壤是微生物的“大本营” 水中微生物：数量仅次于土壤 ? 清水型水生微生物 ? 腐败型水生微生物 ? 海洋微生物
空气中微生物：空气不是微生物生长繁殖的良好场所 生物体内外正常菌群 二、微生物之间的相互关系 互生( metabiosis )：“可分可合，合比分好” ? 微生物间的互生：好氧性自生固氮菌与纤维素分解菌生活在一起时，后者分解纤维素的产物有机酸为前者提供固氮时的营养，而前者则向后者提供氮素营养物。 ? 人体肠道中正常菌群与人的互生 ? 互生现象与发酵工业中的混菌培养 共生( symbiosis )：“难分难解，合二为一” ? 微生物间的共生 ? 地衣是真菌中子囊菌纲或担子菌纲的某些种类与藻类中的单细胞绿藻或蓝细菌共生在一起形成的植物体。其中的绿藻或蓝细菌进行光合作用，为真菌提供有机养料，而真菌则以其产生的有机酸分解岩石，从而为藻类或蓝细菌提供矿质元素。 ? 微生物与植物间的共生 ? 根瘤菌 ---- 豆科植物 ? 菌根菌 ---- 植物 ? 微生物与动物间的共生 ? 白蚁与细菌、原生动物的共生 ? 瘤胃微生物与反刍动物的共生 寄生( parasitism ) ? 微生物间的寄生：细菌与噬菌体 ? 微生物与植物间的寄生 ? 病原微生物与动物间的寄生 捕食或猎食( predatism, predation ) ? 原生动物吞食细菌和藻类 拮抗或抗生( antagonism ) ? 非特异性拮抗 ? 例：乳酸菌和醋酸菌在发酵过程中，不断降低pH，结果绝大多数不耐酸的微生物就不能生存而趣向死亡。 ? 特异性拮抗 ? 例：一种微生物（抗生菌）在其生命活动过程中，能够产生某种或某类特殊的代谢产物（抗生素），具有选择性地抑制或杀死一定种类的微生物（敏感菌）。 竞争（competition） ? 例：两种硅藻混合培养时，它们的混合培养生长率与分别单独培养的相同，但每种硅藻所达到的
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最高密度都会因为另一种藻的存在而降低，这是它们对共需的、有限的营养物进行竞争吸收的结果。 三、微生物在自然界物质循环中的作用 碳素循环（carbon cycle） 氮素循环（nitrogen cycle） 硫素循环（sulfur cycle） 磷素循环（phosphor cycle） 铁的循环（iron cycle）
四、细菌沥滤（ bacterial leaching ）或细菌冶金或细菌浸出 溶矿 置换
再生浸矿剂 实验课件
实验一 普通光学显微镜的使用
一、目的要求
1．学习并掌握油镜的原理和使用方法；
2．复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 1．显微镜的基本构造
? 光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。
? 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。 2． 显微镜的放大倍数和分辨率 ? 放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数
? 显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力 D=λ/2n·sin(α/2)
式中：D——物镜分辨出物体两点间的最短距离 λ——可见光的波长（平均0.55mm)
n——物镜和被检标本间介质的折射率 α——镜口角（即入射角）
3．油镜的使用原理
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、器材 1．菌种
? 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、链霉菌（Streptomyces sp.）、青霉（Penicillium sp.）。
2． 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。
3． 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 四、操作步骤 1．观察前的准备
? 显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。 ? 调节光源 2．显微镜观察 ? 低倍镜观察 ? 高倍镜观察
? 油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 3．显微镜用毕后的处理
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? 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。
五、思考题
1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？
2．试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？
3．什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 4．影响显微镜分辨率的因素有哪些？
5．根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。
实验二 培养基的制备与灭菌
Ⅰ、培养基的制备
一、目的要求
1．明确培养基的配制原理；
2．通过对各类培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。 二、基本原理
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。 三、器材
1．溶液或试剂
? 琼脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl；
? 牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基的配方药品。 2．仪器或其他用具
? 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5.5～9.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 1．称量 2．溶解
3．调节pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。 4．过滤：趁热用四层纱布过滤。 5．分装 6．加塞 7．灭菌 五、思考题
1．培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？ 2．在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？
3．配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入？天然培养基为什么不需要另加微量元素？
4．有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例的基质中，为什么在配制培养基时需要注意各种营养成分的比例？
5．你配制的高氏Ⅰ号培养基有沉淀产生吗？说明产生或未产生的原因。
6．细菌能在高氏Ⅰ号培养基上生长吗？为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施？
7．如果在马丁氏培养基分离真菌时，发现有细菌生长，你认为是什么原因？你将如何进一步分离纯化得到所需要的真菌？
8．马丁氏培养基的pH“自然”，根据你配制前二种培养基的经验和所学知识你认为此培养基灭菌后是应偏酸还是偏碱？为什么？
Ⅱ、灭菌与消毒
一、目的要求
了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
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二、基本原理
灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。 三、器材
培养皿、试管、吸管、电烘箱、牛肉膏蛋白胨培养基，手提式高压蒸气灭菌锅等。 四、操作步骤
1．火焰灼烧灭菌：如接种环或接种针的灭菌 2．干热灭菌 ? 装箱
? 灭菌：160～l70℃ 2h。
? 降温取物：灭菌结束后，切断电源，自然降温至60℃后，取出物品。 3．高压蒸汽灭菌法（以手提式高压蒸汽灭菌锅为例）
? 装锅：先向外层锅内加入适量的水，并装入待灭菌物品。
? 加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。
? 灭菌：加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，升温至l21℃时维持15~20min。 ? 降温取物：灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，开盖取物。 五、思考题
1．在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么？
2．为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要地温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。 3．高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？
4．在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？ 5．灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？
6．黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个更强？为什么？
实验三 微生物的分离纯化 Ⅰ、微生物的分离与纯化
一、目的要求
掌握倒平板的方法和几种常用的微生物分离纯化的基本操作技术。 二、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。 三、器材
1．菌种：米曲霉（Aspergillus oryzae）。
2．培养基：淀粉琼脂培养基（高氏Ⅰ号培养基），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3．溶液或试剂：10％酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4％水琼脂。 4．仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。
四、操作步骤
1．稀释涂布平板法 ? 倒平板
? 制备土壤稀释液 ? 涂布 ? 培养：将高氏Ⅰ号培养基和马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃培养3～5d，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养2～3d。 ? 挑菌落：将培养出的单菌落进行斜面接种，并分别置于25℃和28℃下培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。 2． 平板划线分离法
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? 倒平板 ? 划线
? 挑菌：挑取单个菌落接种到斜面上培养，此后镜检是否为单一微生物。若有杂菌，继续分离纯化。
五、思考题
1．如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。 2．如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜？并说明其理由。
3．如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？写出简明的实验方案（提示：产蛋白酶菌株在酪素平板上形成降解酪素的透明圈）。
4．为什么高氏I号培养基和马丁氏琼脂培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉菌具有抗性的细菌，你认为应如何做？
5． 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形，而只要划一条直线？
6．接种环（针）接种前后烧灼的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断烧灼过的接种环已冷却？
Ⅱ、微生物的菌落形态特征
一、目的要求
了解各大类微生物的菌落形态特征。 二、基本原理
菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。 三、器材
1．菌种：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。
2．培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号合成培养基和马丁氏培养基等。 3．材料：无菌平皿，接种环(针)。 四、操作步骤
1．平板菌落培养
? 细菌、放线菌、酵母菌采用划线法； ? 霉菌采用点种法。 2．菌落形态观察
实验四 细菌的染色法 Ⅰ、细菌的简单染色法
一、目的要求
1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法； 2．初步认识细菌的形态特征；
3．巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。 二、基本原理
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。 三、器材 1．菌种
? 枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物
? 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）约24h营养琼脂斜面培养物 2． 染色剂：吕式碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。
3． 仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。
四、操作步骤
1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
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2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。
3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。 4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。 5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。 6．干燥 7．镜检 五、思考题
1．你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2．为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
3．如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？
Ⅱ、革兰氏染色法
一、目的要求
1．学习并初步掌握革兰氏染色法。
2．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、基本原理
根据细菌细胞壁结构和成分的不同，通过革兰氏染色法可将细菌分为G?菌和G-菌。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G?菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色（紫色）。 三、器材 1．菌种
? 大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物
? 金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物
? 蜡样芽孢杆菌（B.cereus）12～20h营养琼脂斜面培养物 2． 染色剂：革兰氏染色液。
3． 仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。
四、操作步骤
1．制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固体。 2．初染：结晶紫染色1～2min，水洗。 3．媒染：碘液覆盖约1min，水洗。
4．脱色：滴加95%乙醇脱色20～30s，立即水洗。 5．复染：滴加蕃红染色2min，水洗。 6．镜检：干燥后，置油镜观察 五、思考题
1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
2．你怎么运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
3．进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
4．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
5．你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？
实验五 放线菌和霉菌形态的观察
Ⅰ、放线菌形态观察
一、目的要求
1．学习并掌握观察放线菌形态的基本方法；
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2．初步了解放线菌的形态特征。 二、基本原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性菌。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝(或称基内菌丝)和生长在培养基表面的气生菌丝。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。 三、器材 1．菌种
? 细黄链霉菌（Streptomyces.microflavus） ? 青色链霉菌（ S.glaucus） ? 弗氏链霉菌（S.fradiae）
2． 培养基：灭菌的高氏Ⅰ号琼脂培养基。
3． 仪器或其他用具：平皿，玻璃纸，盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片，接种环，接种铲，镊子，石炭酸复红染液，显微镜等。 四、操作步骤
1．扦片法：在高氏Ⅰ号琼脂平板上划线接种，以无菌操作将灭菌的盖玻片以45o扦入琼脂内，倒置28℃培养3～5d后直接镜检。（观察时用暗光，先低倍镜后高倍镜，用0.1％美蓝染色观察，效果更佳。）
2． 玻璃纸法：将已灭菌的玻璃纸片铺在培养基平板上，压平玻璃纸后接种，倒置28℃培养3～5d后直接镜检。
3． 印片法：接种培养后，将平板上的菌苔连同培养基切下，菌面朝上放在载玻片上。另取一载玻片盖在菌苔上，按压（印片用力要轻）、火焰固定后再用石炭酸复红染色液染色lmin，镜检。 五、思考题
1．试比较三种培养和观察放线菌方法的优缺点
2．玻璃纸培养和观察法是否还可用于其他类群微生物的培养和观察？为什么？ 3．镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？
Ⅱ、霉菌形态观察
一、目的要求
1．学习并掌握观察霉菌形态的基本方法； 2．了解四类常见霉菌的基本形态特征。 二、实验原理
霉菌可产生复什分枝菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，并由繁殖菌丝产生孢子。 三、器材 1．菌种
? 曲霉（Aspergikkus sp.）、青霉、根霉（Rhizopus sp.）和毛霉（Mucor sp.）培养2～5d的马铃薯琼脂平板培养物。
2． 培养基：土豆琼脂或察氏琼脂。
3．溶液或试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液。
4．仪器或其他用具：无菌吸管，平皿，载玻片，盖玻片，U形玻棒，解剖针，解剖刀，镊子，50％乙醇，20％的甘油以及显微镜等。 四、操作步骤
1．直接制片观察法：用解剖针挑取已产生孢子的霉菌菌丝，先置于50％乙醇中洗去脱落的孢子，再用乳酸石炭酸棉蓝染色制片镜检。 2． 载玻片培养观察法
（1）培养小室的灭菌：先在皿底铺一张略小于皿底底圆滤纸片，放上U形玻棒、载玻片、盖玻片，灭菌烘干后备用。
（2）琼脂块的制作：切取0.5～1cm2的察氏琼脂块，移取到上述培养室的载玻片上。 （3）接种
（4）培养：先在平皿滤纸上加3～5ml灭菌的20％甘油，28℃培养。
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（5）镜检 五、思考题
1．你主要根据哪些形态特征来区分上述四种霉菌？
2．根据载玻片培养观察方法的基本原理，你认为上述操作过程中的哪些步骤可以根据具体情况作一些改进或可用其他的替代方法？
3．你认为在显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？
实验六 酵母菌形态的观察
Ⅰ、酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别
一、目的要求
1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 2．掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。 二、基本原理
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。 三、器材 1．菌种
? 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养约2d的麦芽汁斜面培养物。 2． 染色剂：0.05％和0.1％吕式碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液。 3． 仪器或其他用具：显微镜，载玻片，盖玻片等。 四、操作步骤
1．美蓝浸片的观察
（1）按无菌操作取少量酵母菌与0.1％吕式碱性美蓝染色液混合均匀，放置约3min后，先用低倍镜后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并用颜色区别死活细胞。 （2）染色0.5h后再次观察，注意死细胞是否增加。 （3）用0.05％吕式碱性美蓝染色液重复上述操作。
2．水－碘液浸片的观察：先滴加碘液后加水，取少量酵母菌混合均匀，盖上盖玻片观察。 五、思考题
1．吕式碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因？ 2．在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？
Ⅱ、酵母菌子囊孢子的观察
一、目的要求
学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。 二、基本原理
子囊孢子是子囊类酵母真菌有性生殖产生的有性孢子，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需一定条件，其中麦氏（McClary）培养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。 三、器材 1．菌种
? 酿酒酵母。
2． 培养基：麦芽汁琼脂斜面，麦氏琼脂斜面。
3． 溶液或试剂：5%的孔雀绿水溶液，0.5％的番红水溶液，95％的乙醇。 4． 仪器或其他用具：载玻片，显微镜等。 四、操作步骤
1．菌种活化：将酿酒酵母移种新鲜的麦芽汁斜面上，25～28℃培养24h，然后再转种2～3次。 2．产孢培养：将活化的菌种转接到麦氏琼脂斜面上，25～28℃培养约一周。 3．制片：取经产孢培养的酵母斜面培养物涂片、干燥、固定。
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4．染色：孔雀绿染色1min。
5．脱色：用95％乙醇脱色30s，水洗。 6．复染：用番红复染30s，水洗。
7．镜检：油镜下，子囊孢子呈绿色，子囊呈粉红色。 五、思考题
如何区别酵母菌的营养细胞和释放出子囊外的子囊孢子？
实验七 微生物细胞大小测定和计数
Ⅰ、微生物细胞大小的测定
一、目的要求
1．学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法； 2．增强微生物细胞大小的感性认识。 二、基本原理
采用目镜测微尺和镜台测微尺测量微生物细胞的大小。测量时，将目镜测微尺放在接目镜中的隔板上，由于目镜测微尺每格实际表示的长度不随显微镜的总放大倍数的放大而放大，仅与目镜的放大倍数有关，只要目镜不变，它就是定值。但由于显微镜下的细胞物象是经过了物镜、目镜两次放大成象后才进入视野的。即目镜测微尺上刻度的放大比例与显微镜下细胞的放大比例不同，只是代表相对长度，所以使用前须用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的每格长度。 三、器材 1．菌种
? 藤黄微球菌和大肠杆菌的染色标本片； ? 酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。
2．仪器或其他用具：目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片，显微镜等。 四、操作步骤
1．安装目镜测微尺 2．校正目镜测微尺
两重合线间镜台测微尺格数?10?m目镜测微尺每格长度?两重合线间目镜测微尺格数3．菌体大小测定
测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出油镜下细菌直径或长、宽所占目镜测微尺的格数。再将所测格数乘以目镜测微尺（油镜）下每格代表的长度，即得该菌的实际大小。每个样品平行测定三次。 五、思考题
1．为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？ 2．在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？
Ⅱ、微生物的显微镜直接计数法
一、目的要求
1．明确血细胞计数板计数的原理；
2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理
血球计数板的计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
由于每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，因而使用血球计数板直接计数时，先要测定5个中方格中的总菌数A，然后求平均数，再乘以25或16，求得大方格中的总菌数，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。设稀释倍数为B，则： 1ml菌液中的总菌数＝A/5×25×10000×B或1ml菌液中的总菌数＝A/5×16×10000×B
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三、器材
1．菌种：酿酒酵母。
2．仪器或其他用具：血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。 四、操作步骤 1．制备菌悬液
2．镜检计数室：保证计数室无污物。
3．加样：用毛细滴管吸取少许酵母菌液，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡。
4．显微镜计数：先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。计数时用16中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的4个中格(即100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外，还需数中央1中格的酵母菌数（即80小格）。 5．清洗血球计数板 五、思考题
1．根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？ 2．某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。
Ⅲ、平板菌落法数法
一、目的要求
学习平板菌落计数的基本原理和方法。 二、基本原理
微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一生理及培养特征进行的。也就是说一个菌落即代表一个单细胞。故又称活菌计数，一般用于生物制品检验以及食品、水源的污染程度的检定。 三、器材
1．菌种：大肠杆菌菌悬液。
2．培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
3．仪器和其他用具：1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。 四、操作步骤
1．编号：分别标明平皿和无菌水试管的稀释度。 2．稀释、取样 3．倒平板 4．计数
每毫升菌落形成单位（cfu）＝同一稀释度三个平板上的菌落平均数×稀释倍数 计数原则：
（1）计算相同稀释度的平均菌落数 ? 有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。 ? 若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计数×2 （2）选择平均菌落数在30～300之间的平板 ? 只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数即为该样品中的微生物总数。 ? 有两个在30～300间时，按两者菌落总数比值决定：比值小于2，取平均；比值大于2，取较小的菌落总数。
（3）所有菌落数均大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数。 （4）所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数。
（5）所有菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数。 五、思考题
1．为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？ 2．要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？
3．试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。
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4．当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？
5．用倒平板法和涂布计数法，其平板上长出的菌落有何不同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？
实验八 微生物的生理生化反应 Ⅰ、大分子物质的水解试验
一、目的要求
1．证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统； 2．掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 二、基本原理
微生物的胞外酶（如淀粉酶、脂肪酶等）将大分子物质的分解过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。 三、器材 1．菌种
? 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，普通变形杆菌。
2． 培养基：固体油脂培养基，固体淀粉培养基，明胶培养基试管，石蕊牛奶试管，尿素琼脂试管 3． 溶液或试剂：革兰氏染色用卢戈氏碘液。
4． 仪器或其他用具：无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架。 四、操作步骤 1．淀粉水解试验
制成淀粉培养基平板后，将平板分为四个区域，划线接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌后置于37℃培养24h。观察各细菌的生长情况，并滴加少量碘液于平皿中。若菌苔周围有透明圈，说明水解反应阳性。透明圈大小可初步判定该菌水解淀粉酶的能力强弱。 2． 油脂水解试验
制成油脂培养基平板后，同样划线接种上述四菌株，置于37℃培养24h后观察各细菌的菌苔颜色，若出现红色斑点，则为脂肪水解阳性。 3． 明胶水解试验
在明胶培养基中穿刺接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌，置于20℃培养2～5d后观察液化情况。 4． 石蕊牛奶试验
接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌于石蕊牛奶培养基中，置于35℃培养24～48h后观察培养基颜色变化情况。石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性为紫色，而被还原时为白色。 5． 尿素试验
接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌于尿素培养基中，置于35℃培养24～48h后观察培养基颜色变化情况。尿素酶存在时为红色，否则为黄色。 五、思考题
1．你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ 2．不利用碘液，你怎么证明淀粉水解的存在?
3．接种后的明胶试管可以在35℃培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？ 4．解释在石蕊牛奶中的石蕊为什么能起到氧化还原指示剂的作用？ 5．为什么尿素试验可用于鉴定Proteus细菌？
Ⅱ、糖发酵试验
一、目的要求
1．了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用； 2．掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 二、基本原理
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应。有些细菌分解某种糖能产酸产气，而一些细菌只产酸不产气。如本次试验的大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；而普通变形杆菌只能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变黄色（pH5.2），气体的产生可由倒置的德汉氏
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小管中有无气泡来证明。 三、器材 1．菌种
? 大肠杆菌，普通变形杆菌斜面各一支。
2． 培养基：葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支（内装有倒置的德汉氏小管）。 3． 仪器或其他用具：试管架，接种环等。 四、操作步骤
取葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支，分别接种大肠杆菌和普通变形杆菌，第三支不接种，作为对照。置于37℃培养24～48h后，观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。 五、思考题
假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
Ⅲ、IMViC与硫化氢试验
一、目的要求
了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道鉴定中的意义和方法。 二、基本原理
IMViC是吲哚、甲基红、伏－普和柠檬酸盐四个试验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。 三、器材 1．菌种
? 大肠杆菌，产气肠杆菌。
2．培养基：蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基。 3．溶液或试剂：甲基红指示剂，40％KOH，5％α－萘酚，乙醚，吲哚试剂等。 四、操作步骤 1．接种与培养
（1）将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中（硫化氢试验）置37℃培养48h。 （2）将上述两菌分别接种于蛋白胨水培养基（吲哚试验）、葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验和伏－普试验）及柠檬酸盐斜面培养基中，置37℃培养2d。 2．结果观察
? 硫化氢试验：观察黑色硫化铅的产生。
? 吲哚试验：培养2d后加入3～4滴乙醚和2滴吲哚试剂，产生红色环状物为阳性反应。
? 甲基红试验：往葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变红为阳性，变黄为阴性。
? 伏－普试验：葡萄糖蛋白胨水培养物内各加入5～10滴的40％KOH和5％α－萘酚溶液，用力振荡后，放入37℃温箱中保温15～30min，若培养物呈红色为伏－普反应阳性。
? 柠檬酸盐试验：观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性。 五、思考题
1．讨论IMViC试验在医学检验上的意义。
2．解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
3．为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏－普试验最初底物与最终产物有何异同处？为什么会出现不同？
4．说明在硫化氢试验中，醋酸铅的作用，可以用哪种化合物代替醋酸铅？
实验九 微生物的诱发突变
一、目的要求
通过实验观察紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应，并掌握基本方法。 二、基本原理
紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素，它使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二
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聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。
本实验以紫外线作为单因子诱变剂处理产生淀粉酶的枯草芽孢杆菌BF7658，根据诱变后菌株在淀粉培养基上透明圈直径的大小指示诱变效应。 三、器材
1．菌株：枯草芽孢杆菌BF7658。 2．培养基：淀粉培养基。
3．溶液或试剂：碘液，无菌生理盐水，盛4.5ml无菌小试管。
4．仪器或其他用具：1ml无菌吸管，玻璃涂棒，显微镜，紫外线灯（15W），磁力搅拌器，台式离心机，振荡混合器等。 四、操作步骤 1．菌悬液的制备
菌苔需振荡离心（3000r/min，10min）后，制成108个/ml的菌悬液。 2．平板制作
倒27皿淀粉琼脂培养基，凝固备用。 3．紫外线处理
（1）紫外灯预热20min。
（2）菌悬液加入到平皿内，共两皿，同时放入一根无菌搅拌棒。
（3）将上述2个平皿先后置于磁力搅拌器上，打开板盖，在距离30cm，15W的紫外灯下分别搅拌照射1min和3min。（计时从开盖起，加盖止。需先开磁力搅拌器，再开盖照射。） （4）稀释：将照射的菌悬液稀释成10－1～10－6。
（5）涂平板：取10－4～10－6的稀释样品涂布，各3皿。（从紫外线照射处理开始，直到涂布均在红灯下进行）。以同样的操作，取未经紫外线照射的菌液进行稀释涂布作为对照。 （6）培养：将上述平板用黑布包好，置于37℃培养48h。 （7）计数
存活率（％）＝处理后每毫升cfu数/对照每毫升cfu数×100
致死率（％）＝（对照每毫升－cfu数处理后每毫升cfu数）/对照每毫升cfu数×100
（8）观察诱变效应：选取cfu数在5～6的平板滴加碘液数滴，分别测量透明圈直径与菌落直径，并计算其比值（HC比值）。与对照组相比较，说明诱变效果。透明圈越大，淀粉酶活性越强。 五、思考题
1．本实验中用亚硝基胍处理细胞应用了一种简易有效的方法，并减少了操作者与亚硝基胍的接触。能否用本实验结果计算亚硝基胍的致死率？为什么？如果不能，你能设计其他方法来计算致死率吗?
2．1997年8月15日“中国科学报”报道，我国第17颗科学卫星搭载的糖化酶生产菌黑曲霉T101菌株经15d太空“航行”后产生较大变异。科研人员成功选育出糖化酶活力比地面对照株高出20％～30％的菌株。你认为可能的诱变因素是什么？
3．请设计用生长谱法筛选氨基酸缺陷型的简明方案。
实验十 水的细菌学检查 Ⅰ、水中细菌总数的测定
一、目的要求
1．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法； 2．了解水源水的平板菌落计数的原则。 二、基本原理
本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中的细菌种类繁多，因而采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基培养出的细菌总数仅是一种近似值。 三、器材
1．培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水。
2．仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 四、操作步骤 1. 水样的采取
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（1） 自来水：先将自来水龙头灼烧3min灭菌，再放水流5min后接取水样。 （2） 池水、河水或湖水：取距水面10～15cm的深层水样。
2. 细菌总数测定 （1） 自来水
吸取1ml水样与平皿内冷却至45℃的培养基混匀，于37℃下培养24h计数，共两皿。同时做不接水样的空白皿对照试验。
（2） 池水、河水或湖水
－1－2－3－2－3
? 采用平板菌落计数法：一般中等污秽水样，取10、10、10三个稀释度，污秽严重的取10、10、10－4三个稀释度。
? 最后三个稀释度的稀释水样重复上述自来水的细菌测定试验。 3．菌落计数方法
（1）计算相同稀释度的平均菌落数
? 有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。
? 若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计数×2 （2）选择平均菌落数在30～300之间的平板
? 只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数。
? 有两个在30～300间时，按两者菌落总数比值决定：比值小于2，取平均；比值大于2，取较小的菌落总数。
（3） 所有菌落数均大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数。 （4） 所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数。
（5） 所有菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数。
表1 计算菌落总数方法举例 例次 不同稀释度的平均菌落数 两个稀释菌落数之度菌落数比 之比 （个/ml） 10－1、 10－2、 10－3、 1 2 3 4 5 6 1365 2760 2890 无法计数 27 无法计数 164 295 271 1650 11 305 20 46 60 513 5 12 —— 1.6 2.2 —— —— —— 16400 37750 27100 513000 270 30500 五、思考题
1．从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用标准？ 2．你所测的水源水的污秽程度如何？
3．国家对自来水的细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计其测定条件（诸如培养温度、培养时间等）来测定水样总数呢？为什么？
Ⅱ、多管发酵法测定水中大肠菌群
一、目的要求
1．学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法； 2．了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。 二、基本原理
多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验。
初（步）发酵试验：利用大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气的原理，但初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产
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气的均需进行平板分离。
平板分离：采用伊红美蓝琼脂平板，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。
复发酵试验：以上阳性菌落，经染色为革兰氏阴性无芽孢菌者，再次进行初发酵试验，经24h培养产酸产气的，最终确定为大肠菌群阳性结果。 三、器材
1．培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。
2。仪器或其他用具：载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。 四、操作步骤
1．水样的采取（同实验Ⅰ） 2．自来水检查
（1）初（步）发酵实验
将水样分别接入三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）中，37℃培养24h，24h未产气的继续培养48h。 （2）平板分离
将经24h和48h培养后产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃培养18～24h，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。 ? 深紫黑色，有金属光泽；
? 紫黑色，不带或略带金属光泽； ? 淡紫红色，中心颜色较深。 （3）复发酵试验
将镜检为革兰氏阴性无芽孢菌的菌株重复初步发酵试验。并根据初发酵管试验的阳性管（瓶）查表1，即得大肠菌群数。
3．池水、河水或湖水等的检查
分别将100ml、10ml、1ml原水样和经稀释成10－1、10－2的水样重复上述自来水的检查，其中100、10、1、10－1ml水样的发酵结果查表2，10、1、10－1、10－2ml水样的发酵结果查表3，即得大肠菌群数。 五、思考题
1．大肠菌群的定义是什么？
2．假如水中有大量的致病菌——霍乱弧菌，用多管发酵技术检查大肠菌群，能否得到阴性结果？为什么？ 3．EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？ 4．经检查，水样是否合乎饮用标准？
附表如下
表2 大肠菌群检数表
接种水样总量300ml（100ml 2份，10ml 10份） 0 1 2 100ml水量的阳性管数 每升水样中大每升水样中大每升水样中大10ml水量的阳性管数 肠菌群数 肠菌群数 肠菌群数 0 <3 4 11 1 3 8 18 2 7 13 27 3 11 18 38 4 14 24 52 5 18 30 70 6 22 36 92 7 27 43 120 8 31 51 161 9 36 60 230 10 40 69 >230
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表3 大肠菌群检数表
接种水样总量111.1ml（100ml、10ml、1ml、0.1ml各1份） 接 种 水 样 量 / ml 100 10 1 0.1 每升水样中大肠菌群数 <9 － － － － 9 － － － ＋ 9 － － ＋ － 9.5 － ＋ － － 18 － － ＋ ＋ 19 － ＋ － ＋ 22 － ＋ ＋ － 23 ＋ － － － 28 － ＋ ＋ ＋ 92 ＋ － － ＋ 94 ＋ － ＋ － 180 ＋ － ＋ ＋ 230 ＋ ＋ － － 960 ＋ ＋ － ＋ 2380 ＋ ＋ ＋ － >2380 ＋ ＋ ＋ ＋ “＋”大肠菌群发酵阳性；“－”大肠菌群发酵阴性。
表4 大肠菌群检数表
接种水样总量11.11ml（10ml、1ml、0.1ml、0.01ml各1份） 接 种 水 样 量 / ml 10 1 0.1 0.01 每升水样中大肠菌群数 <90 － － － － 90 － － － ＋ 90 － － ＋ － 95 － ＋ － － 180 － － ＋ ＋ 190 － ＋ － ＋ 220 － ＋ ＋ － 230 ＋ － － － 280 － ＋ ＋ ＋ 920 ＋ － － ＋ 940 ＋ － ＋ － 1800 ＋ － ＋ ＋ 2300 ＋ ＋ － － 9600 ＋ ＋ － ＋ 23800 ＋ ＋ ＋ － >23800 ＋ ＋ ＋ ＋ “＋”大肠菌群发酵阳性；“－”大肠菌群发酵阴性。 实验十一 活性污泥中原生动物与菌胶团的观察
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一、目的要求
学习并掌握原生动物与菌胶团的观察方法。 二、器材
1．样品：活性污泥法曝气池混合液。
2．仪器或其他用具：显微镜、小量筒、滴管、擦镜纸等。 三、操作步骤 1．观察前的准备
? 显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。 ? 调节光源 2．取样
将活性污泥法曝气池混合液轻轻搅拌均匀，若混合液较浓，则可稀释成1：1的液体，用滴管吸取少量液体观察。 3．观察
? 显微观察原生动物与菌胶团的形态并绘图。 ? 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗
2000年福州大学研究生入学试题 微生物学 （真题试卷06年后就没有了） 一名词解释 20%
芽孢 主动运输 有氧呼吸 溶原性细菌 质粒 拮抗 食物中毒 光能自养型 光复活作用 菌胶团
二判断题，并说明错题错误原因30%
1细菌只通过革兰氏染色法的草酸铵结晶紫染色，碘液固定和酒精处理步骤，不能分辨出革兰氏阳性与革兰氏阴性细菌
2细胞内有酶的结构基因，但只有在该酶催化的底物存在时结构基因才合成酶，这种酶称为阻遏酶。 3噬菌体的寄主细胞是细菌，因此，对利用细菌进行发酵的工业造成严重的危害。 4毒素、抗菌素、色素是微生物的次级代谢产物
5当前，卫生检疫部门都把检测细菌、大肠菌群以及病原菌作为食品最基本的卫生指标 6缓慢冷冻对细菌的损害，不如快速冷冻那样大
7酵母是真核微生物，都会产生子囊孢子,放线菌和霉菌的孢子都是单细胞的
8食品中细菌数量越多,在致死因素作用下所需要的时间 越长;食品中的营养成份对微生物的热致死有保护作用
9大多数细菌,霉菌都可以直接利用淀粉蛋白质,但酵母不行,因为酵母菌不能把产生的酶分泌到细胞外 10放线菌和霉菌都是丝状多核微生物或多细胞微生物,霉菌与放线菌的菌落都有具有颜色,其它特征也相似
11高压蒸气灭菌比干热空气灭菌温度低时间短,是因为蒸气的穿透力较热空气强 12厌氧微生物常用的培养方法有抽真空法,添加亚硫酸钠法等
13肉鱼等蛋白质食品腐败变质主要的被分解成氨,胺等产物,果疏的溃烂是酸败
14嗜冷微生物可在零度以上生产,在零度以下不能生长,嗜热微生物是在45℃以上还能生长的微生物 15种是指在某些地区或某一实验室分离到的菌种
三选择题,在空格中填上一种或一种以上的答案序号15%
1下列发酵属厌氧气性发酵的是____,属于好氧性发酵的是____ A柠檬酸发酵B酒精发酵C谷氨酸发酵D青霉素发酵 2酸菜,豆腐乳,糯米酒曲,它们中主要的微生物是____ A酸菜中有乳酸菌,豆腐乳中有根霉,糯米中酒曲中的根霉 B酸菜中有乳酸菌,豆腐乳中毛霉,糯米酒曲中有根霉
40
C酸菜中有醋酸菌,豆乳中有毛霉,糯米酒曲中有根霉 D酸菜中有醋酸菌,豆腐乳中有根霉,糯米酒曲中根霉
3微生物在有含淀粉,糖,蛋白质,氨基酸的基质中先利用___ A糖,氨基酸B糖,淀粉C氨基酸,蛋白质D糖,蛋白质 4紫外线杀菌的机理是___
A基因突变B产生胸腺嘧啶二聚体C碱基移码D碱基替换
5解酚细菌氧化酚产生碳化合物,硫细菌氧化硫化氢等产生硫化合物,它们产生的产物分别被对方利用,这种关系称为___
A共生B互生C竞争
6测定不同微生物的数量一般用____,筛选产淀粉酶高的菌株一般用___ A选择培养基B基础培养基C鉴别培养基D加富培养基
7下列酶类都可以用微生物发酵法获得,目前国内生产量最大的酶是____ A果胶B脂肪Cａ-淀粉酶Dβ-淀粉酶 8啤酒,罐头,饮料等灭菌的要求是____
A只杀死病原菌B杀死全部微生物C达到商业灭菌 9 70%的乙醇杀菌机理是___,甲醛的杀菌机理是___
A和蛋白质结合变性沉淀B使蛋白质脱水变性C具有还原作用与蛋白质的氨基结合 10放线菌和大多数细菌的最适PH范围是___,酵母,霉菌的最适PH范围是___ A7.2—7.6 B7.0—7.6 C4—5C 5—6
11分离微生物的方法有___,可以作为微生物细胞数量测定的方法有___ A平板涂布法B划线法C平板倾注法D比浊法E重量法
12常用的微生物保藏方法是___,能保藏几年的方法是___孢子的最佳保藏法是___ A沙土管冷藏B斜面冷藏C真空冷冻干燥D石蜡油隔氧冷藏
13下列原料在发酵工业上常作为氮源的是___常作为提供生物素的是___ A糖蜜B玉米浆C豆饼D氨水 14酶的激活剂有___抑制剂有____
A钙,钠,钾,镁等离子B氨基酸,维生素等C银,汞,铜等离子 15最可能使干燥食品变质的微生物是___ A芽孢,孢子B霉菌C细菌D放线菌
四问答题35%
1简述微生物育种的方法和特点,微生物的变异株可以从哪些方面进行判定筛选?现要从自然界中筛选并育种获得分解纤维素较强的菌株,请你设计该菌种选育的可行性方案.(注意菌种选育的分离尖,培养基设计及各筛选步骤的条件等问题)20%
2大肠杆菌在肉汤培养基中经37℃培养48掌上明珠,期间出现了怎么样的生长繁殖规律?为什么会出现这样的生长繁殖规律?该规律适用哪些微生物类群?在发酵和食品行业的应用上具有哪重要的指导意义?15%
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2001年福州大学研究生入学试题 微生物
一 名词解释20%
原生质体 噬菌斑 化能异养型 菌株 基础培养基 基因突变 诱导酶 营养缺陷型 水分活度 同步生长 二 填空15%
1.观察细菌采用____染色法,在___物镜下进行,霉菌,酵母的形态观察制片是____片,即让细胞____溶剂中,物镜选择____即可,通过细菌革兰氏染色法呈___色的菌体称____,呈_____色的菌体称____.细菌的这种不同的革兰氏反应属性是由于______________________
2普通培养基灭菌最常用的方法是__________;玻璃器皿及金属器皿则常用_____灭菌;牛奶,饮料,酒类的消毒灭菌采用____法;手及皮肤的消毒常用_____%_____溶液;厂房,环境,车间常用_________消毒;无菌室,空气的灭菌采用_____、_______法等
3衡量细菌,酵母菌生长时细胞的增殖情况可以采用______法,_____法,______法与______法测定;衡量放线菌,霉菌细胞的生长情况宜采用_______,_______,_______.在这些方法中______法是测定活细胞的.
4从菌落上辨别四大类微生物时,一般认为细菌的菌落________________,酵母菌的菌落_________________,放线菌的菌落____________________,而霉菌的菌落_________.
5菌种保藏中___保藏法效果最佳,这是因为综合了___,______,_____三大条件,保藏霉菌,放线菌常采用_______法,而最常用的菌种短期保藏法是______保藏法,这种方法一般每隔_______时间重新移接一次,菌种复壮采用的方法是
三,判断题,并说明错题错误的原因20% 1细菌的形态变化后不能恢复其正常形态.
2.原核微生物与呼吸代谢有关的酶存在于线粒体中.
3.无氧呼吸是指基质脱下氢与电子交给了氧气以外的无机物.
4.质粒是具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子,质粒上携带有某些染色体上所没有的基因,赋予细菌某些对其生存并非必不可少的特殊功能.
5.影响微生物热致死量的因素有加热温度和加热时间.
6.蛋白质.氨基酸等含氢有机物在氧化细菌作用下生成氨,氨在硝化细菌作用下生成硝酸盐,这两种微生物之间的关系是共生关系.
7.在最适生长温度下,微生物的代谢速率最快,得到的发酵产物也最多. 8.溶源性细菌是指基染色体上带有温和性噬菌体.
9.在检验饮用水的质量时,通常把大肠杆菌数作为重要指标.
10.大肠杆菌细胞内钾离子的浓度约为胞外环境钾离子浓度的3000倍,可见大肠杆菌对钾离子的吸收是通过促进扩散的方式进行.
四,简述题: 20%
1.微生物学发展史可分为几个阶段? 各时期的杰出代表人物及其所做的主要贡献. 2.试述芽孢.荚膜的特性及其在实践中的应用与危害.
3.在微生物培养过程中,引起PH值改变的原因有哪些?在实践中如何保证微生物能处于较稳定和合适的PH环境中?
4.紫外线引起的胸腺嘧啶二聚体对微生物有何影响?什么是光复活作用?它的作用机制怎样?
五. 问答题: 25% 试讨论利用微生物的遗传变异性选育生产上优良菌种的方法及其特点和应用,并请设计从自然界中筛选产高活力蛋白酶菌株的可行性方案.(从分离源,培养基,培养条件,菌种选育步骤,菌种优良性能的测定等方面分析)
2002年福州大学研究生入学试题 微生物
一名词解释20%
原生质体 融合 选择培养基 原噬菌体 诱导酶 互生 恒化连续培养 光复活作用 菌种复壮 休眠体 基团移位
二选择题10%
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1细菌的呼吸代谢类型是___放线菌的呼吸代谢类型是____,酵母菌的呼吸代谢类型是____,霉菌的呼吸代谢类型是____
A好氧呼吸B厌氧呼吸C兼性厌氧呼吸D好氧呼吸或厌氨呼吸E好氧呼吸或厌氧呼吸或兼性厌氧呼吸
2培养细菌常用的培养基是_____,培养放线菌常用的培养基是____,培养酵母菌常用的培养基是____,培养霉菌常用的培养基是____
A高氏一号培养基B察氏培养基C牛肉膏蛋白胨琼脂培养基D葡萄糖发酵培养基E麦芽汁培养基
3微生物的初级代谢产物有___,次能代谢产物有____ A抗菌素B柠檬酸C乙醇D色素
4铁细菌氧化亚铁形成高铁获能,并用无机碳合成细胞物质,铁细菌发球___微生物.发酵工业上使用的菌种基本属于___微生物,藻类的营养类型是____
A光能自养型B光能异养型C化能自养型D化能异养型
5微生物学的奠基人是指___
A科赫B列文虎克C巴斯德D胡克
6影响加压蒸汽灭菌的最主要因素是___
A灭菌物体的含菌量B灭菌锅内空气排除程度C灭菌对象的体积D灭菌对象的PH值
7霉菌的主要繁殖方式是___ A芽殖B产芽孢C产孢子D裂殖
8在培养产酸菌时,为控制培养基PH值最好采用____
A调节培养基初始PH至偏碱性B添加PH缓冲剂C添加固体碳酸钙
9 70%的乙醇杀菌机理是___,甲醛的杀菌机理是____
A和蛋白质结合变性沉淀B使蛋白质脱水沉淀C具还原作用与蛋白质的氨基结合
10采用平板菌落计数法测定果汁样品中的细菌含量,分别吸取10-1,10-2,10-3的稀释样品1.0ml与培养基混匀,经保温培养后其结果如下;
稀释度 10-1 10-2 10-3 平均菌落数2760 295 46 则该果汁样品中的细菌含量为_____个/ml
A 176000 B 295000 C 37750 D 46000
三 判断题,并说明错题错误的原因18%
1所用的诱变剂量越大,获得的菌株突变率就越高
2任何一种微生物只要提供适量的碳,氮,无机盐,水分就能生长 3任何微生物都可以借助光学显微镜来观察形态 4菌体衰老是由于异化作用大于同化作用
5好氧微生物与厌氧微生物在有氧条件下混合培养时,只有好氧微生物生长,厌氧微生物不生长 6微生物在最适生长温度时增代时间最短,发酵速度最快 7放线菌细胞壁的结构组成与细菌相同
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8线粒体是微生物的呼吸代谢场所,核糖体是微生物的蛋白质合成部位. 9 C/N比是指微生物培养基中碳源重量与氮源重量之比 四简述题27%
1从保藏的原理,对象,效果等方面来比较几种最常用的菌种保藏方法. 2试比较灭菌,防腐,消毒的异同,并举例说明
3测定微生物的生长量常用哪几种方法?试比较它们的优缺点与适用范围. 4简述温度对微生物的影响以及微生物热致死作用的影响因素.
5单细胞微生物的典型生长曲线可分为几个暑期?每个时期有何特点?该生长曲线对实践应用有何指导意义?
五问答题25%
1根据你对微生物的认识,从工农业,医药,环保等方面来谈谈微生物对人类社会的贡献与危害.
2请举一个例子说明微生物诱变育种工作的基本环节有哪些?并结合你所举例子设计一个能高效筛选该菌株优良性能的方案(包括实验步骤,具体条件,注意事项等)
2003年福州大学研究生入学考试试题 微生物
一 名词解释30%
荚膜子 溶源菌 鉴别性培养基 巴氏消毒法 恒浊器 接合 变异 完全缺陷噬菌体 互生 质粒
二判断改错,并说明错题错误的原因30%
1在菌种保藏中,砂土管保藏法效果最好,适用于各大类微生物
2放线菌的主要作用是产生抗生素.抗菌素生素对人体由病原菌引起的疾病的治疗作用是非特异性拮抗作用,酸泡菜制作过程中由于PH下降抑制了其它微生物的生长是特异性拮抗作用
3细菌通过结晶紫染色,碘液固定,沙黄复染等步骤,可以鉴别出革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌
4紫外线杀菌力和穿透力强,并具有光复活作用,常用于空气,物体的消毒灭菌以及菌种的诱变育种. 5淀粉,蛋白质,脂肪的苗头物,微生物均可以直接吸收利用 6食品经过消毒处理后处于无菌状态
7病毒细胞由蛋白质的二种核酸(DNA和RNA)组成,是专性寄生微生物
8细菌培养在含青霉素素的培养基中,产生了抗青霉素的突变体,所以青霉素是诱变因子 9湿热灭菌的效果比干热灭菌好,原因在于蒸汽的穿透力强 10发酵工业上的发酵与生物氧化或能量代谢上的发酵含义相同
三,简答题48%
1有4支分别接种着细菌,放线菌,酵母菌,霉菌的平板,请你用最简便的方法来确定4株菌的类型 2试举例说明了噬菌体在基因工程中的应用 3营养物质进入细胞有几种方式 ,试比较之.
4什么叫菌种衰退?如何区别衰退,饰变和杂菌污染?
5连续培养或连续发酵有何优点?为什么连续的时间总是有限的?
6如何根据微生物的生态分布规律来设计一个”初级”培养基?试举例说明
7什么叫最适行生长温度?温度对同一微生物的生长速度,生长量,代谢速度,代谢产物累积量的影响是否相同?研究这一问题有何实践意义?
8什么叫能源?试以能源为主,碳源为铺,对微生物的营养类型进行分类,并举例说明每一种营养类型有何特点?
四问答题42%
1什么是生物工程学?试述微生物与生物工程学的关系.
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2生物素营养缺陷型是谷氨酸发酵的生产菌株,如何从现成的谷氨酸野生型菌株中选育出生物素营养缺陷型,请设计实验方案.(包括实验步骤,实验方法,培养基,筛选条件等)
2004年福州大学研究生入学试题学 微生物 一,名词解释
补充培养基 种 防腐 生长因子 溶菌酶
生物氧化 菌落 转化 特异性拮抗 分解代谢物阻遏
二.判断改错,并说明错题错误的原因: 30%
1.微生物吸收营养物质的主要方式是促进扩散和主动运输. 2.在发酵生产中,整个培养过程必须保持相同的温度和PH值.
3.在培养微生物时,放线菌常用察氏培养基,酵母菌常用麦芽汁培养基,霉菌常用高氏一号培养基. 4.紫外线诱变在暗处进行,是为了增强诱变作用的效果. 5.细菌和放线菌都属于化能异养型微生物.
6.病毒.类病毒和朊病毒都是专性寄生微生物,均由蛋白质和核酸组成. 7.由于外界理化因素刺激引起细胞形态变化后,不能再恢复.
8.质粒是存在于细胞核中,但独立于染色体外的具有独立复制能力的小型环状DNA分子.
9.在同一细胞中,假如一个基因的突变率是10-8,另一个基因的突变率是2×10-8,则该细胞发生这两个基因双重突变的几率是3×10-8.
10.阿垃伯糖乳杆菌自身不能合成苯丙氨酸,粪链球菌自身不能合成叶酸,但当这两种菌混合培养在既无苯丙氨酸又无叶酸的培养基上时,都能正常生长,那么这两种菌的相互关系是共生.
三.简答题.48%
1.简述噬菌体的类型及基各自的生活史.
2.微生物有哪些独特代谢特点?这对理论与实践有何指导意义?
3,用操纵子学说解释大肠肝菌β_半乳粮苷酶的合成机制(请画图说明).
4.简述单细胞微生物的生长规律以及出现该规律的原因,并说明该规律对发酵工业有何指导意义? 5.结合革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的细胞壁结构特点,解释革兰氏染色法的作用机制. 6.在发酵工业上,测定细菌.放线菌.酵母菌.霉菌的生长量各有哪些常用方法?
7.讨论培养基.玻璃器皿.接种室.车间.牛奶.啤酒消毒灭菌的常用方法以及选择依据. 8.试比较有氧呼吸.无氧呼吸.发酵的异同点.
四.问答题:42%
1.为什么说微生物学是一门实践性很强的新兴学科? 15%
2.请利用微生物学的遗传变异原理,设计从自然界中选育产高活力纤维素酶的菌株的可行性 方案.(从分离源.培养基.培养条件.菌种选育步骤.菌种优良性能的测定等方面分析) 27% 福州大学2005年招收硕士研究生入学考试试题
一． 名词解释：
1．碳氮比 2。转导 3。无氧呼吸 4。共生。 5。连续培养。 6．菌株。 7。消毒。 8。基因突变。 9。菌种复壮 10-。营养缺陷型
二．判断改错，并说明错题的原因；
1．原核微生物与呼吸代谢有关的酶存在于线粒体中。
2．类病毒是一类只含环状单链RNA分子，并进行专性细胞内寄生的分子生物。 3．来源于同一个细胞，在液体培养基中形成的肉眼可见的细菌群体称为菌落。
4．根据培养器内菌体生长的密度,通过光电系统来控制培养基流速的连续培养称为%%%养。 5．用镜台测微计对同一酵母菌涂片测量其大小时，在1000保下的大小比在450倍下大。 6．细菌除基本形态外，在特定条件下还会出现异常形态----畸形和衰颓形。 7．温和噬菌体侵入寄主细胞后，始终不裂解。
8．脂多糖是一切原核微生物细胞壁外膜中所持有的成分。
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9．最早创立用固体培养基将细菌进行培养的科学家是法国的巴斯基。
10．在较低浓度范围内即可影响微生物生长速率和菌体产量的营养物称为生长限制因子。
三．简答题：
1．什么是选择性培养基？它在微生物学工作中有何重要性？试举一例并分析其中的选择性原理。 2．什么叫生物氧化？试分析非生物性的氧化（燃烧）与生物氧化间的异同。
3．试从细胞结构，核酸种类，繁殖方式，培养方式以及对青毒素的敏感性5个方面比较细菌与病毒的差异。
4．简述单细胞微生物的生长规律以及出现该规律的原因，并说明该规律对生产实践有何指导意义？》 5．在没有显微镜的条件下，用哪些实验方法可初步判断某细胞是否具有鞭毛？列举两种方法说明。 6．在微生物实验中，对接种环。培养皿。肉汤蛋白胨培养基。实验台桌面以及无菌室内空气分别采用哪些方法灭菌？写出灭菌条件。
四．问答题。
1．微生物学中有哪几项技术算得上是独特的？简述其原理并说明这些技术的创建对发展微生物所作的贡献。
2．发酵工业为何常遭噬菌体的危害？如何检验。预防和治理它？
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